质粒DNA的制备

    有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。

    目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。

1.碱变性法质粒提取的原理：

    根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

    在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。

    通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，zui后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。

2.碱变性法提取质粒的步骤：

（1）取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；

（2）加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震荡悬浮菌液。

（3）加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。

（4）加入150毫升冰冷的溶液III，（*29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升）颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。

（5）离心的上清液用*抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。细胞