质粒DNA的大量制备
在丰富培养基中扩增质粒 
细菌的收获和裂解 
收获 
碱裂解法

（一）在丰富培养基中扩增质粒 许多年来，一直认为在*存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2－5mg质粒DNA，而且重复性也很好。ELISA试剂盒 
1）将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。 
2）将含相应抗生素的 500ml ＬＢ或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）施放入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分），所得培养物的OD 600值约为0.4。 
3）可做可不做：加2.5ml*溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170μg/ml。像 pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用*进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入*略显不便，但用*处理还是利大于弊。 4）于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。

（二）细菌的收获和裂解
1．收获 
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。 
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 
STE 
0.1mol/L NaCl 
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
2）按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。ELISA试剂盒

2，碱裂解法 
1）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中。 
溶液Ｉ 
50mmol/L 葡萄糖 
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
10mmol/L EDTA(pH8.0) 
溶液Ｉ可成批配制，在 10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。 
2）加1ml(2ml)新配制的*溶液 [10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，*不能有效工作。 
3）加 20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。 
溶液Ⅱ 
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 
1％SDS 
盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
4）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。 
溶液Ⅲ 
5mol/L乙酸钾 
60ml 冰乙酸 
11.5ml 水 
28.5ml 所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。 
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放 10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。
5）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4）]。 
6）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。 
7）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。 
8）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使zui后残余的痕量乙醇挥殆尽。 
9）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。ELISA试剂盒