凝胶染色方法对蛋白质分辨率的影响

提高双向凝胶电泳的分辨率是蛋白质组学研究尚待解决的课题及技术发展方向，影响蛋白质分辨率的因素较多，其中凝胶染色方法对蛋白质分辨率的影响不可忽视，它影响了实验的显像结果，直接干预了后续的质谱鉴定。ELISA试剂盒目前，在蛋白质组学领域中广泛应用的是考马斯亮蓝染色法和银染法两种。

考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue，CBB G-250)的化学名称为二甲花青亮蓝，偏酸性，与蛋白质的碱性基团结合，颜色由棕黄色转为深兰色。考马斯亮蓝染色法可以达到微克级检测水平，着色程度与蛋白量的线性动力学相关范围广，适合定量分析。该法由于较低的成本、使用方便及与下游的质谱鉴定技术的良好相容性，而得到了非常广泛的使用。然而微克级的检测水平使它漏检了相当多的低丰度蛋白质，日益成为蛋白质组学的瓶颈，因此大量提高染色灵敏度的研究及各种染色液的配方和方法应运而生，经文献报道的方法众多，评价不一。我们的试验选择了3种常用的考马斯亮蓝染色法进行比较，测得传统考马斯亮蓝染色法的灵敏度可达几百纳克，胶体考马斯亮蓝染色法能检测到几十纳克蛋白，改良考马斯亮蓝染色法则可达几纳克蛋白水平。考马斯亮蓝染色法经过改进能获得高的蛋白质检测灵敏度，甚至可与银染媲美。

银染法是利用银离子与氨基酸共价结合，还原剂的加入使与胶内蛋白质结合的银离子形成金属银而显色。文献报道检测限度可低于1 ng的蛋白质，其灵敏度比传统考马斯亮蓝染色法高约100倍，被广泛应用于蛋白质组学研究，但银染步骤复杂，繁琐，且着色线性动力学的覆盖范围窄，导致蛋白质差异显示的不准确性，同时由于游离银离子及相关试剂的存在，给后续分析及鉴定带来一定的实际困难。我们的实验只采用了一种银染法，结果显示银染法的灵敏性高于所有考马斯亮蓝染色法，4 ng的蛋白质条带也能显现，但蛋白质鉴定成功率低。ELISA试剂盒

蛋白质检测灵敏度的影响因素

蛋白质着色显示的灵敏性既取决于染色试剂，如上述分析，又与染色过程中涉及的有机溶剂及离子有关。在考马斯亮蓝染色法和银染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有机溶剂的使用。甲醇和乙醇在染色里起固定作用，把蛋白质固定在凝胶中或阻滞它们在凝胶中扩散。同时也去除电泳过程中的干扰染色过程的物质，如去垢剂、还原剂和缓冲液等成分。乙酸的作用既是辅助固定蛋白质同时又维持染液的酸性度，以利于考马斯亮蓝与蛋白质结合。他们的存在有利于获得背景清晰、信噪比高的图像。由于3种有机溶剂的相似作用，我们在胶体考马斯亮蓝染色法及改良考马斯亮蓝染色法里，保留乙醇作为*的固定清洁剂，用磷酸替代乙酸发挥酸化作用，结果显示两种考马斯亮蓝染色法获得的图像背景比传统考马斯亮蓝染色法的要清晰，条带也锐利。

在胶体考马斯亮蓝染色法中，酸性的乙醇介质中加入硫酸铵，使得着色剂形成胶体染色颗粒，胶本身可不被显著着色，蛋白染色灵敏度得以提高。而在改良考马斯亮蓝染色法中，在高酸、高离子环境下，蛋白质的葡糖胺和天冬酰胺酸质子化，更利于与染色剂发生结合。因此2种染色法呈现出背景清晰、蛋白检测多的图像，且在改良考马斯亮蓝染色法中由于高酸、高离子存在，灵敏度出现提高，几接近银染水平。

甲醛在银染中发挥还原剂作用，使结合在蛋白质上的银还原而显色。甲醛浓度影响银染效果，浓度一般为400～500μl/L。甲醛浓度较高时胶颜色发黄，背景色混杂，难以发现目的点;浓度较低不仅染色时间延长，而且不易着色。银的络合剂*防止自由银离子还原为金属银，可减少非特异染色，降低背景染色，其浓度一般为0.1～0.2mg/L。该络合剂用量过多，胶颜色过深;少则不足以螯合掉游离的银离子，胶颜色发黑。ELISA试剂盒

质谱兼容性的影响因素

考马斯亮蓝G-250在一定的pH时，这种染料-蛋白质复合物被*解聚。适应于蛋白质的质谱鉴定;而银染使用的银离子及醛类造成肽间的相互交连，影响胶内蛋白质酶解及洗脱，降低了蛋白质质谱分析的氨基酸序列覆盖率，考马斯亮蓝染蛋白质鉴定的成功率在60%～80%之间，远高于银染鉴定的成功率(30%～60%);而我们的结果是，前者的质谱鉴定成功率为50%，后者仅为5%。鉴于此，我们也在不断地寻找新的方法，以提高银染鉴定的成功率。