1)训练目的

    掌握动物细胞培养中的无菌操作技术；为后续实验如细胞传代培养、细胞纯化和冷冻保存等实验提供材料；掌握细胞原代培养中常用的组织块培养法和消化培养法的操作要领。

2)实验材料

①材料：妊娠10一14 d的小鼠。

②试剂：75％乙醇、Hank’s液、DMEM培养液(含10％FBS和抗生素)、1份0．25％*加1份0．02％乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。

③器材：超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、离心机、高压灭菌锅、电热干燥箱、酒精坷、分析天平、吸管弯头和直头和胶帽、细胞培养瓶、培养皿、烧杯(100 mL)、*、*、镊子、解剖盘、不锈钢筛(100目)、离心管(10 mL)、计数板。

3)操作步骤

(1)组织块培养法

①取材：将妊娠10一14 d的小鼠用引颈处死，然后将其整个浸入盛有75％乙醇的烧杯中5 s，取出后放入已经消毒的肾形解剖盘中，用普通*、*在动物躯干中部环形切开皮肤，并将两侧皮肤分别拉向头尾把动物反包，暴露躯干。用眼科剪、*切开动物腹肌和腹膜，并取出含有胎儿的两侧子宫放入60 min培养皿中，剖开子宫体，取出胎儿，在Hanks's液体内洗去血液、羊水、胎膜等杂物后放入另一培养皿。

②剪切：去除胎儿头、尾及内脏，只留下胎儿四肢及躯干部分，在Hank's液内洗2～3次去除血污后，放人60 mm培养皿或*小瓶内，用眼科剪、*反复将小鼠胎儿剪切成1 mm3的小块。

③接种：用弯头吸管吸取若干组织小块，置于培养瓶中；用吸管弯头把组织小块接种到培养瓶底上，小块相互距离5 min为宜，每25 mL培养瓶可接种20～30块。

④黏附培养：组织块放置好后，吸净培养瓶内的培养液，轻轻将培养瓶翻转，使接种组织块的瓶底向上。注意翻转瓶时勿使组织块流动，盖好瓶盖，将培养瓶放置于CO2培养箱内37℃培养2—4 h，使组织块微干并黏着在培养瓶底上。

⑤培养：从培养箱中取出培养瓶，开盖，瓶底向上，从瓶底角部加入1 mL*DMEM培养液；然后缓慢 翻转培养瓶，让培养液慢慢覆盖附着于培养瓶底的组织小块，置培养箱中培养。待细胞从组织块游出数量较多时，再补加培养液至约3 mL。

    在翻转培养瓶和加液过程中，严禁动作过快产生冲力，使黏附的组织块漂起而造成原代培养失败。若组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂上薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。

    组织块培养也可以不用翻转法，即在接种组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，放入培养箱内培养24 h再补加培养液。

(2)消化培养法

①取材与剪切：同组织块培养法：

②消化：将剪切后的组织小块移入10 mL离心管内，加入2 mL的O 25％*+0.02％EDTA组成的消化液，室温下消化15～20 min，期间用吸管吹打数次，并随时吸取少量消化液在显微镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞。则立即加入8 mL含5％FBs的Hank’s液终止消化。

③用吸管反复吹打组织块，分散单细胞，用100目不锈钢网筛过滤，收取滤出液，2 000 r／min离心5 min，弃上清液。

④用Hank，。液重悬细胞，2 000 r／min离心5 min后弃上清液；重复漂洗两次，以去除细胞悬液中的细胞碎片等。

⑤用2 mLDMEM+10％FBS培养液悬浮细胞，计数并稀释细胞浓度至(1～5)×106个／mL，加细胞悬液入培养瓶。置37℃、5％C02培养箱中静置培养，24 h后，更换新培养液，此后每3 d换液1次。

4)注意事项

①消化培养法效率较高，可得到大量的原代细胞用于培养，但操作步骤较多，操作时要特别注意，以防微生物污染而导致培养失败。

②对于不同的组织需用不同的消化方法，一般而言，胚胎类软组织用*或EDTA即可得到理想的消化效果，而对于成体组织由于存在大量的细胞外基质，需用胶原酶，有时配合使用半透明质酸酶会加速消化过程。

③在组织消化过程中要随时取样进行观察，发现组织已分散成细胞团或单个细胞时应立即终止消化，以免消化过度影响细胞的贴壁生长。

④细胞接种浓度不宜过大，否则会影响贴壁和细胞生长。