（一）样品的制备

    在这部分内容中，主要描述了直接收集细胞内总蛋白的方法、用免疫沉淀获得蛋白质的方法，及其随后用双向电泳分离、用银染或West-ern印迹检测的样品制备。如果采用了其他的检测方法，如GST或His-pul-down时，可以类似地制备等电聚焦的样品，然后再参照本章部分2中步骤进行后续的样品制备。在整个操作过程中，应该佩戴手套，以避免任何可能的外来性蛋白污染。

    “直接收集细胞内总蛋白”进行双向电泳分析与“免疫沉淀等其他操作获得的蛋白质样品”进行双向电泳在本质原理上没有区别，但在样品制备过程中的处理有所不同。因为双向电泳进行时，上样体系中要求低盐（是无盐，以免干扰电泳进行）。所以前者在一开始处理时，就要求用双向电泳的裂解缓冲液进行细胞裂解；而后者在细胞裂解时无特殊处理，而在免疫沉淀后获得的蛋白质样品就需要经过低盐、无去污剂的缓冲液洗涤处理，然后再进行后续电泳。

1.直接收集细胞内总蛋白进行双向电泳

    根据试验需要，进行细胞培养或相应处理（如不同的药物刺激或状态）。按照我们的实验经验，一般的贴壁细胞让其生长到90%满度以上时提取细胞蛋白较好。具体细胞数量，根据细胞种类不同而异，如P19细胞，175cm2的培养瓶（细胞数为108数量级）可以收获8--10mg的总蛋白。而一次2D电泳（指能满足后续考染、质谱分析）需要的蛋白量是0.8--1mg。而且，由于上样体系总体积的限制，zui终获得的溶液蛋白浓度不能低于8mg/ml。（Ramsbyetal.1994；Tayloretal.20）

（1）细胞的清洗

    在加入裂解液裂解细胞之前，应充分洗涤细胞，尽量去除培养液中的蛋白和其他成分，同时又应避免引入过多的离子。选择使用低离子强度的等渗缓冲液作为细胞漂洗液（washsolution）。

    使用中等渗的*溶液漂洗细胞，漂洗液使用以前在4℃冰箱预冷。加漂洗液时让其从培养瓶侧壁流下，避免产生的冲力使细胞从瓶壁上脱落。轻巧地转动培养瓶，使漂洗液流过整个培养瓶的内壁，漂洗3耀4遍。zui后一遍漂洗完后，尽量倒干漂洗液，然后将瓶口向上侧倾插入冰中预冷，细胞贴壁一面应*与冰接触。放置15min，让残余的漂洗液流到瓶底一角，用巴斯德管将其尽量吸干。

（2）细胞的裂解，蛋白提取

    新鲜配置细胞裂解液（lysisbufer），同时加入适量 DNAseI、RNAseA（终浓度0.5mg/ml）。如：底面积为75cm2的培养瓶加入裂解液约30μl（裂解液体积为细胞沉淀体积的3耀5倍），让其流过整个细胞贴壁面，将培养瓶置于冰上放置10耀20min裂解，用细胞刮子将裂解后的细胞刮下吸入1.5ml的Ependorf管中，冰上超声处理（具体超声条件需要根据不同的细胞和仪器进行优化，比如我们的经验：输出功率60--10W，超声3--5s，间歇60s，共3--10个循环），超声后细胞悬液应变得澄清透亮。然后4℃，140rpm离心40min，保留上清。上清取样立即进行蛋白浓度的测定，余下的蛋白样品根据蛋白浓度的测量结果进行分装（如1毫克/支），置-80℃备用。

2.免疫沉淀等其他操作后获得的蛋白质样品进行双向电泳

（1）细胞裂解

根据试验需要，培养细胞并进行相应处理。

1）用PBS洗涤细胞三次，刮下贴壁的细胞，转移至一个EP管中。

2）细胞180g离心3s，去除PBS。

3）加入裂解缓冲液（每1×106个细胞加入大约10μl裂解液），吹打混匀，冰上孵育15min。

4）细胞于4℃，180g离心15min。

5）上清转移至新的EP管中。

6）采用Bradford等方法分析上清中的蛋白浓度。

（2）相互作用蛋白的分离

    用共价交联至Sepharose珠子的抗体进行免疫沉淀。在大规模制备蛋白复合物时，zui常采用的是固定至ProteinA或ProteinG的Sepharose珠子的抗体。过量的免疫球蛋白会影响蛋白质的等电聚焦以及二向分离。将抗体固定至珠子能克服这些问题。

1）裂解物的预清除：用细胞裂解液洗涤ProteinG或ASepharose珠子，共3次（每个样品用20μl珠子）。商品化的Sepharose珠子常以50%悬液的形式保存在20%乙醇中。在20μlProteinG或ASepharose珠子中加入0.5--2mg的蛋白裂解物，4℃摇床孵育1h。该步骤可以移除与珠子非特异性结合的蛋白。

2）离心珠子，将经过预清除的裂解物转移至一个新的 EP管中，EP管中预先加有10耀20μl抗体交联的珠子。4℃摇床孵育2h或过夜。

3）用裂解液洗珠子，共3次，并用低盐无去污剂的缓冲液（10mmol/LNaCl，50mmol/LTris-HCl pH7.4，5mmol/LEDTA）洗涤一次。尽量移除残余的缓冲液。

4）室温加入 含0.01%溴酚蓝（或吸取少许）和2%pH3--10的两性电解质的2D用裂解液。对于18cm长的IPG胶条，终体积应该为350μl（或根据生产商的说明）。如果使用的是管状胶，终体积不一定需要调整至350μl。zui终的上样体积取决于胶和玻璃管顶端的间距。用2D裂解液来调整体积。将样品混匀，室温孵育几分钟，然后离心。将上清上样至*向凝胶。