DNA聚合酶及其应用

（一）大肠杆菌DNA聚合酶I

是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：ELISA试剂盒

5′→ 3′聚合酶活性（模板， 带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。

双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性。

3'→5'核酸外切酶活性。

从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。

大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途

1.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。

2.用于DNA连接前的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。

3.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。ELISA试剂盒

（二）Klenow片段酶

Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。

酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性

⑵3’ →5’ 的核酸外切酶活性

Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：

⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端

⑵标记DNA片段的末端

底物用［α－32P］－dNTPs

⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成

⑷DNA序列的测定

（三）T4 DNA聚合酶

T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，

1.酶催活性：

⑴5′→3′的聚合酶活性

⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强100～1,000倍。

因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：

如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 ′→ 5 ′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。

2.T4DNA聚合酶的用途

(1)利用取代合成反应制备探针

(2)标记具有平末端的或具有3’－隐蔽末端的DNA片段

利用较强的3 ′→ 5 ′外切酶活性和 5′→3′聚合活性

(3)用于DNA序列分析

（四）逆转录酶（反转录酶）

逆转录酶 是一种依赖RNA的DNA聚合酶。

此酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。

zui普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）分离出来的。ELISA试剂盒

活性：一种可以有效地将mRNA反转录成DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).

主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。