质粒载体的改造

⑴去掉不必要的DNA区段。细胞

⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。

⑶加入易于捡出的选择性标记基因。

⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。

⑸改造或增加基因表达的调控序列。

1、质粒pBR322

结构：

（1）氨苄*抗性基因（ampr或Apr）

内部有3种限制酶单一识别位点 。

（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）

内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点 。

（3）DNA复制起点（ori）

pBR322质粒的优点：

（1）具有较小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，

（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

（3）具较高的拷贝数，而且经过*扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。

（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。

2、pUC质粒载体

1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。

结构：

（1）来自于pBR322的Ori

（2）氨苄*的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化

（3） LacZ′基因

编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。

（4）MCS区段

是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是*的。

与pBR322相比， pUC质粒载体优点：

（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数

如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝

（2）适用于组织化学法检测重组体

通过a-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。

（3）具有多克隆位点区段（MCS）

可以定向克隆防止载体自我连接。