亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号：QYS-232029

分光光度法 50管/24样

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

亚硝酸还原酶（NiR）试剂盒测定意义

硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为 NO 或 NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

亚硝酸还原酶（NiR）试剂盒测定原理

亚硝酸还原酶可将 NO₂^—还原为 NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的 NO₂^—减少，即 540nm 处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、、研钵、可见分光光度计、水浴锅、低温离心机、1mL 玻璃比色皿。

的组成和配制

提取液：液体 80mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂 1 瓶，4℃保存。 临用前加 12mL 蒸馏水溶解。

试剂三：液体12ml×1 瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）。

试剂四：液体25ml×1 瓶，4℃避光保存。 （如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）。

试剂五：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

工作液：临用前，根据用量将试剂四 和试剂五 按 1:1 的比例混合。

酶液提取

• 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
• 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。
• 注意：空白管只需测定一次。
• 计算公式

标准曲线：y = 1.3594x +0.0072，R² = 0.9997

x为标准品浓度（μmol/mL）y为吸光值（A 标准管-A 空白管）

1．按照蛋白含量计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/mg prot）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷1.3594×V 反总÷（V 样×Cpr） ÷T= 1.47×（A 空白管-A 测定管+A 对照管+0.0072）÷Cpr

2.  按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每小时还原 1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/g  鲜重）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)+0.0072]÷1.3594×V 标÷（W×V 样÷V样总）÷T=1.47×（A 空白管-A 测定管+A 对照管+0.0072）÷W

• 按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴ 个细胞每小时还原 1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/10⁴ cell）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)+0.0072÷1.3594×V 反总÷（细胞数量 ×V 样÷V 样总）÷T= 1.47×（A 空白管-A 测定管+A 对照管+0.0072）÷ 细胞数量

V 标：标准液体积，0.2mL；V 样：体系中加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒注意事项

• 配制好的试剂三、试剂四 3 天内使用完。
• 若吸光值超过3，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数
• 严格控制显色时间，否则会对结果有影响。
• 标准曲线线性范围为0.03umol/mL-1.5umol/mL。
• A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-3

注：电子试剂盒说明书仅供参考、具体请参考试剂盒纸质版说明书。