1.  用经脱气的HPLC级水洗去反相柱的有机溶剂，梯度从100%有机溶剂到100%水，流速1 ml/min，持续15 min 以上。

2.  以100%的TFA/乙腈缓冲液平衡柱子至柱压和光吸收值达到恒定。用10~15 min 的线性梯度使之逐渐转到0.1%TFA水溶液，并以0.1%TFA平衡15 min。

3.  进行空白样品的层析检查柱子：流速1 ml/min，0~100%TFA/乙腈缓冲液线性梯度，时间45 min 以上，保持在100%TFA/乙腈缓冲液5 min，然后以15 min 的线性梯度回复到0.1%TFA，保持15 min。

4.  将RP多肽恃准或多肽消化的混合物于5000 g 离心5 min。用HPLC只进样器吸取上清，并加之于注射样品环中。

5.  按步骤3的梯度进行层析。收集层析峰于不同的聚丙烯管中。如果柱子的使用间隔时间超过两天时间的话，需要清洗柱子并贮存于有机溶剂中。

6.  用TFA/胍缓冲液溶解收集到多肽，用旋涡混合器使之溶解。

7.  在5 000 g 离心5 min， 并完成第二次如用于氨基酸序列分析，应直接将样品加到供测序用的玻璃纤维滤膜如用于氨基酸成分分析，在合适的容器中干燥小份样品并进行后续的水解。