一、冻存

1.  细胞

选项对数生长期细胞；收集细胞24 小时前换液一次；

2.  计数

按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达5×106 /ml （如一瓶细胞数量不足则用两瓶或更多的细胞），离心去上清， 吸入离心管中；

3.  冻存液

先用培养液9 分+DMSO 1 分（或甘油）配成10%的DMSO冻存液；按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬；

4.  分装

分装入无菌安瓿中，每安瓿加1.5 毫升细胞悬液；

5.  封口

用塑料安瓿时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安瓿口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安瓿缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找；

6.  冻存

当前已有细胞冻存器；在无冻存器的情况下，可用手工办法；从把冻存物悬在液氮罐口开始算起，按－1 ℃分钟速度，在30~40 分钟内，下降到液氮面，再停30 分钟后，直投入液氮中。

二、复苏

1.  从液氮罐中取出安瓿；有时因安瓿未封严，浸入了液氮，取出后因安瓿内液氮迅速气化而发生爆炸（力量有限），因此应带防护眼镜和手套；

2.  迅速放入盛有36 ℃~37 ℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻；

3.  剪开纱布口袋，取出安瓿，用70%酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖（如为玻璃安瓿则折断安瓿颈部；用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10 ml 培养液，吹打使细胞悬浮）；

4.  低速离心（500~1000 转/分）5 分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心；

5.  加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。