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细胞蛋白质总量样品的制备
2023-10-12 阅读(726)
简介
蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。
与细胞总蛋白的提取实验相似的是动物组织的总蛋白提取，它需要匀浆机或者研磨棒将组织块分散，再加入裂解液并提取蛋白质。
原理
细胞蛋白的提取是生物学实验中一种常见的实验方法，是很多其他生物学实验的前提。通过加入裂解缓冲溶液以及相应的蛋白酶抑制剂，能较好的保持细胞内生物大分子的天然状态，在透膜剂以及超声破碎仪的辅助下，细胞将发生破裂，内容物释放出来。
用途
1. 蛋白免疫印迹；
2. 蛋白免疫沉淀；
3. 核浆分离等制备型和分析型实验。
材料与仪器
细胞、细胞刮、裂解液、枪头、烧杯、超声破碎仪，离心机，EP 管，制冰机，记号笔。
步骤
一、蛋白提取
1. 从培养箱中取出待提取的细胞，用吸引器洗掉培养基后，将培养皿置于冰上；
2. 往培养皿中加入适量的裂解液，并加入相应量的蛋白酶抑制剂，一般来说，12 孔板加入100 μL 裂解液，6 cm 皿加入 300-400 μL 裂解液，晃动培养皿，使得裂解液流过细胞表面；
3. 在冰上用细胞刮将细胞刮离培养皿，并收集到 1.5 mL EP 管中；
4. 在冰上超声破碎细胞（根据仪器的功率调节），一般超声 10-15 下即可；
5. 超声好的细胞放入离心机中，12000 g，4℃，离心 15 分钟；
6. 离心完后，取出 EP，小心的将上清液转移至一干净的 EP 管中，待用。
二、蛋白浓度的测定
1. 取 96 孔板，5 孔，每孔加入 10 μL 0.9% NaCl，最后一孔加入 10 μL 2 mg/ml 的 BSA 溶液，在倒数第二孔加入 10 μL BSA，用移液枪吹打混匀之后，吸出 10 μL 至倒数第三孔中，同样操作一直至第二孔混匀后，弃 10 μL 溶液，此为标准曲线孔；
2. 另取孔，每孔 8 μL 0.9% NaCl 溶液，再加入 2 μL 提好的蛋白溶液；
3. 按照蛋白浓度测定试剂盒的说明配制好测定液，在上述浓度测定孔中每孔加入 200 μL 混合液，将平板放入 37℃ 生化箱中孵育 15-20 分钟，再用酶标仪测定，做出标准曲线并计算每个蛋白样品的浓度；
4. 提取好的蛋白上清液加入等量的 2 x loading buffer，并在沸水中煮沸 15 分钟；
5. 一般细胞样品按照 30 μg 的总上样量计算出相应的上样体积，记录备用，并用于后续实验。
注意事项
1. 有些蛋白容易降解，所以样品需要一直放在冰上，样品用完后短期负二十冰箱保存；
2. 勤换枪头，避免交叉污染；
3. 超声的次数和功率不能剧烈，容易使得蛋白断裂；
4. 检测磷酸化蛋白，尽量添加磷酸酶抑制剂；
5. 由于某些蛋白的特性，样品不需要煮沸。
常见问题
1. 蛋白拖尾？
可能是超声太过剧烈，并且超声太过剧烈，对于一些小体积的样本，非常容易造成样品飞溅，损失样品。
2. 蛋白浓度太低？上样量太大？
应按照个人经验和不同细胞的特性，适当的调整裂解液加入的体积，并且在最后可以加入 5 x loading buffer 来变性样品。
