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温度梯度PCR和降落PCR区别大吗
2009-11-16 阅读(4183)
温度梯度PCR是指在退火温度不太明确时，为了找到*退火温度，在一台PCR仪上同时做多管PCR，每一管放在仪器内不同列（有的是不同行）上，分别进行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分别为50，52，54，56，58，60度），zui后看看哪个温度的效果。总之是用来进行退火温度优化的。
降落PCR是在同一个PCR管内进行PCR，只是每个循环的温度不同（如每个循环降1度）。一般兼并引物用这种方法多些。
设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并zui终低于这个水平，用于确保*个引物—模板杂交事件发生在zui互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度zui终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于*滞后（非特异）PCR产物的地位。
降落PCR是在同一个PCR管内进行PCR，只是每个循环的温度不同（如每个循环降1度）。一般兼并引物用这种方法多些。
设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并zui终低于这个水平，用于确保*个引物—模板杂交事件发生在zui互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度zui终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于*滞后（非特异）PCR产物的地位。
由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。
则：从65℃—>50℃（每2cycles降退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。
实验中如持续出现假象带（杂带），则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。
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