细胞冻存与复苏的操作方法

    1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。1959年Lovelock等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜。

    按添加保护剂后的冻存液在冷冻后是否形成冰晶，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种：非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-80~-70℃，然后投入液氮进行保存。该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成；玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护剂保护悬液细胞，直接投入液氮进行保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。玻璃化冻存对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较繁琐的操作有关。

    目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。

1)细胞复苏时半量换液法的应用

    细胞复苏的原则为快速解冻，避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，导致细胞死亡。解冻后是否立即去除冷冻保护剂，依细胞种类而异，一般而言大都不需要立即去除冷冻保护剂。若要立即去除，则向解冻的细胞悬浮液加入含有5~10 mL培养基，离心l 000 r/min,5 min,移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后第2天更换培养基，以清除残留的冷冻保护剂等对细胞的影响。

    对于一些娇气的细胞，生长比较慢，它们自身会分泌一些生长因子，如果换液使用全 量的话，会骤然改变细胞的生存环境，细胞可能因为不能适应新的环境而导致生长发育滞缓，甚至死亡。这样对细胞的生存和增殖都不利，甚至可能改变细胞的一些生物学性状：所以，换液时使用半量换法，当第二次换液的时候，就可以全量换了。对于普通的肿瘤细胞，一般是换全液的，特殊情况特殊对待。

2)普通冰箱短期保存细胞的方法研究

    细胞培养技术是生物医学研究中广泛使用的实验手段，细胞冻存又是细胞培养技术中的一个重要环节。

液氮冻存细胞是长期保存细胞的传统方式，但实际应用中该方法有几个不便：

①液氮罐通常是实验室的紧张资源，而且需要经常填充液氮。研究工作经常会出现研究人员时间变动、实验试剂购买等待和研究预料外结果出现等，一旦疏忽未及时补充，导致研究进展受阻，损失不可弥补，对实验造成严重的不良影响。

②使用液氮的便利条件不同。除了大的科研单位、院校实现了液氮采购的专门负责人，规模小的单位则需要科研人员自己购置。

③液氮保存细胞的成本高。所以一般的细胞研究工作需要低成本方便的保存手段。

    利用普通冰箱短期冻存培养细胞是一种方法。有研究资料证明，将对数期生长的贴壁细胞，在生长90％融合时换液，第二天弃去全部液体，加入相近培养液体积的细胞冻存液(含10％二甲基亚砜的细胞培养剂)，然后parafilm膜封口，先于冰箱中4℃下放置30 min,然后转入-20℃冻存。细胞每过一个月同时复苏两瓶细胞，一瓶培养，一瓶进行细胞存活检查。冻存一个月的细胞存活率可达20％，而冻存2个月的细胞存活率不足10％。

    这种操作方式在细胞冻存时，不需要*消化和离心操作，节约资源，在简陋的条件下，为研究工作提供非常有益的帮助。当然，这种方法也存在着局限，复苏时间与冻存时间成正比，冻存时间不能太长。

    也有利用-70℃低温冰箱对细胞进行长期保存研究资料，在长达8个月的保存时间内，复苏细胞，细胞与液氮保存细胞复苏效果相同。