细胞常规检查观察的方法

    原代培养是指直接从机体取出细胞、组织和器官后立即进行培养，原代培养是建立细胞系的*步。因此，较为严格地说原代培养是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把*代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养，原代培养的细胞叫做细胞株，一般持续1～4周。

    细胞在体外培养过程需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态以及细胞有无移动、污染、培养基pH值是否变酸、培养基变黄是否需要更换等．细胞常规检查观察的方法有以下4种：

1)肉眼观察

    一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养基的颜色和透明度的变换。正常情况下，培养基pH值介于7.2～7.4，呈桃红色，清亮透明。细胞加入培养瓶中在恒温箱培养时，随着细胞生长时间的延长，细胞生长旺盛，细胞代谢产生的酸性物质会使培养基pH值下降，引起颜色变浅变黄。如不及时调节pH值，会影响细胞的生长，甚至造成细胞蜕变死亡。另外，如发现培养基很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养皿没有洗干净。也可在显微镜下仔细观察有无污染。一般更换培养基的时间由营养物的消耗而定，通常每周换液两次，每次半换量或1/5—1／3量。若细胞生长停滞、死亡，则培养液颜色变红或紫红色，培养液pH值上升。总之，培养基颜色一旦出现变化，需要进行换液培养。原代细胞*次换液培养时一定不要把原培养液全部倒掉，因为培养液中带有体细胞分泌的细胞因子，能提升细胞体外存活率。

2显微镜观察

    为保持原代细胞的生长活力，在培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态及培养基颜色的改变。生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构c。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡．崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。

3)细胞的生长状态观察

    细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一个长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽相同，传代细胞系、胚体组织和幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第2天即可见细胞生长增殖，3～4 d便可连接成片。成体组织、老年组织和癌组织潜伏期更长，可达1周左右。原代细胞培养中zui先可见组织块边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生的。这种早期游离出的细胞多数是成纤维细胞，易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期、对数生长期、细胞大量繁殖、逐渐相连成片而长满瓶底。通常情况下，发现细胞覆盖瓶底的80％就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至导致细胞脱落。当发现悬浮细胞生长显著、密度增大、分布稠密、培养基变黄也应及时传代。

4)微生物污染的观察

    细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养基浑浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等应怀疑是否有微生物污染，进一步观察检查并及时处理。

(1)组织块培养法

    将组织块剪成小块．去除不健康和坏死的部分，并用吸管吹打均匀，然后放到含有少量培养基的培养器瓶中(培养器皿根据不同细胞的生长需要做适当处理，如在表面涂胶原薄层，以利于上皮细胞等的生长)，竖立放置培养瓶让组织块可以贴附到培养瓶的底部，然后放平培养瓶，细胞将沿瓶壁迁移增殖，使组织块脱离培养基lO～15 min，然后用物理或化学的方法收集贴壁的细胞，移到另一个细胞培养瓶中培养。该方法适合获得组织比较少的情况时的培养：大多数细胞，在3 d以前就可以看到细胞的迁移，对于迁移快的细胞，会在组织块周围形戚“生长晕”；迁移性不强的细胞，如神经细胞，可能在3 d只有很少细胞会迁移。

(2)消化培养法

    将动物*成小块，放到无菌容器中，加入足够体积的蛋白酶消化液(可以覆盖整个容器底部，液面高过组织块)，置于37℃环境中，每隔半个小时晃动一次容器，直至组织块消化*，或者将含有组织块的消化液放到4℃冰箱中消化过夜。

(3)器官培养法

    将整个器官或者具有代表性的部分不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，并能存活，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和。器官培养的目的和技术与单层细胞培养不同，它是保持相同类型或不同类型的细胞的原有的结构关系以及由此产生相互作用，并观察研究不同培养条件对器官组织的影响。器官培养分析主要依靠组织学的技术，不宜进行生物化学和分子生物学分析。