软琼脂克隆形成试验

    琼脂是一种简单的生长基质，可帮助细胞贴附生长。本法适用于病毒转化细胞或恶性肿瘤细胞等易于悬浮培养的细胞，观察其单个细胞的增殖能力。其他大多数细胞易于被琼脂中含有的酸性硫酸多糖所抑制，因此不适用于此试验。

一、材料

1．培养成层的待测细胞。

2．O．25％*。

3．20％胎牛血清DMEM培养液及2×DMEM(含20％FCS)培养液。

4．0．7％和1．2％琼脂糖溶液。

5．直径6cm或10cm的细胞培养皿(或24孔培养板)、吸管、试管、三角烧瓶、水浴箱等。

二、方法

(一)琼脂培养液的制备

1．用双蒸馏水配制成1．2％琼脂糖和O．7％琼脂糖。经高压蒸汽灭菌(67．6 kPa)后储存备用。

2．准备进行培养时，将琼脂加热融化，室温冷却至50℃左右时，浸入45℃水浴中保持融化状态。

(二)制备细胞悬液

    取对数生长期细胞，用0．25％*消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，做活细胞计数，用含20％胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106／ml。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(三)制备底层琼脂

1．用灭菌蒸馏水分别制备出1.2％和0．7％两个浓度的低熔点琼脂液，维持在40℃水浴中不会凝固。

2．按1：1比例使1.2％的琼脂和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入直径6cm平皿中(10 cm平皿加7～10ml)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

(四)制备上层琼脂

    按1：1比例将0．7％的琼脂和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后取2．7ml，再向管中加入0．3ml的细胞悬液(6cm平皿)，充分混匀．注入铺有1．2％琼脂底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养10～14d。

三、结果分析

    逐日将平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆(集落)数并计算集落形成率。

    集落形成率=形成集落数／接种细胞数×100％

四、注意事项

   软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。