免疫荧光组织化学染色法

(一)免疫荧光组织化学原理

    将已知抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受到激发光的照射会发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，荧光素受激发光照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子不稳定，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光。利用荧光显微镜可观察荧光所在细胞或组织，从而确定抗原或抗体性质和定位，以及利用定量技术测定含量。

(二)荧光抗体染色法

1．直接法

(1)染色：切片经固定后，滴加经稀释至染色效价的荧光抗体，在室温或37℃染色30min。切片置入湿盒内，防止干燥。

(2)洗片：倒去荧光抗体，将切片浸入pH 7．2磷酸盐缓冲液(PBS)中洗两次，电磁"振动，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。

(3)50％碳酸盐缓冲甘油(O．5mol／L碳酸盐缓冲液pH 9．O～9．5)封固、镜检。

    直接法相对简单，适用于细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗体如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应抗原，特异性高而敏感性相对低。

2．间接法(双层法)

(1)切片固定后用毛细管吸取适当稀释的免疫血清滴在其上，置于湿盒中，37℃作用30min。用O．01mol／LpH 7．2 PBS洗涤两次，每次5min，用滤纸吸去多余液体。

(2)再滴加问接荧光抗体(如兔抗人γ一球蛋白荧光抗体等)，同上步骤，37℃染色30min，PBS洗涤两次，每次5mirt，振动，缓冲甘油封固，镜检。

3．间接法(夹心法)

(1)切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。

(2)滴加未标记的特异性抗原与切片作用于37℃，30min。

(3)PBS缓冲液洗涤2次，每次5min，吹干。

(4)在切片上滴加特异性荧光抗体，37℃，30 min。

(5)PBS缓冲液洗涤两次，每次5min，吹干。

(6)缓冲甘油封固，镜检。

4．补体方法

(1)材料和方法

1)免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers；盐水作2倍稀释，为1：2，1：4，1：8…补体用10倍稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述补体法染色。免疫血清补体结合效价如为1：32，则免疫血清应用l：8倍稀释。

2)补体用新鲜豚鼠血清一般作l：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按两单位的比例，用K。lmers盐水稀释备用。

Kolmers盐水配制是在pH7．4的0．1mol／L PBS中溶解MgSO4，其终浓度为O．01％。

3)抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为两单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolrners盐水稀释备用。

(2)方法

1)涂片或冰冻切片用冷丙酮10min固定和PBS洗涤一次，约3min，吹至组织表面无水分。

2)吸取经适当稀释的免疫血清及补体的等量混合液(此时免疫血清及补体又都各稀释一倍)滴于切片上，37℃作用30min，置于湿盒内。

3)用PBS缓冲液洗涤2次，搅拌或振动混匀，每次5m·n，吸于标本周围水分。

4)滴加经适当稀释的抗补体荧光抗体，37℃作用30min，水洗同上。

5)蒸馏水洗涤lmin，缓冲甘油封固。

5．膜抗原荧光抗体染色法

    用直接法或间接法原理及步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常于T和B细胞、细貔培养物、瘤细胞抗原和受体等的研究，阳性荧光主要在细胞膜上。

6．双重染色方法

(1)一步法双染色法：先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行姿色。

(2)二步法双染色方法：先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的A抗体染色，按间接法进行。

(3)结果：经FITC标记的A抗原阳性荧光呈现绿色，经RB200标记的B抗原阳性呈现橘红色荧光。

(三)荧光抗原染色法

    某些抗原可用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同：用荧光抗原可直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法与荧光抗体染色的直接染色法相同。由于多数抗原难以提纯或量少昂贵，一般很少采用此法。