内皮细胞的传代培养法

    当培养吼或培养瓶内的内皮细胞形成致密的单层时，应进行传代，否则对细胞生长不利。步骤如下：

1．洗涤细胞PBS洗涤细胞2次。

2．消化细胞加入O．05％*溶液1ml消化单层细胞，镜下可见细胞立即变圆、收缩。弃去*，利用培养瓶内残余*进行消化。当观察到大部分细胞脱落或漂浮起来时加入培养液，终止*的消化作用。

3．培养细胞用滴管吹打壁上的细胞，使其*脱离和分离。按l：2的比例接种于培养皿或培养瓶中进行培养。

一、结果分析

通过培养可获得生长良好的内皮细胞，可用下述方法对其进行鉴定。

1．光镜观察倒置相差显微镜下可见内皮细胞呈菱形或多角形，融合成片后可形成鹅卵石状镶嵌排列。

2．电镜观察刚贴壁的内皮细胞呈长多角形，并向四周伸向细长的突起，融合成片后细胞呈多角形。细胞表面有微绒毛，也有的细胞质膜凹陷。胞核呈椭圆形，个别稍凹陷·核仁明显。细胞之间具有间隙，伸出突起相连。位于边缘的细胞呈收缩状态，胞体*微绒毛收缩成小泡状。

3．因子Ⅷ相关抗原免疫荧光检测  由于因子Ⅷ只存在于内皮细胞、巨核细胞和血小板中，故因子Ⅷ相关抗原是鉴定体外培养内皮细胞zui可靠的标志。操作步骤如下：

(1)固定内皮细胞：内皮细胞用PBS冲洗干净，放人乙醇一丙酮混合液(1：1)中固定10min，在空气中自然干燥。

(2)加入抗体：加入因子Ⅷ相关抗原抗血清(如兔抗人因子Ⅷ相关抗原抗血清)，37℃孵育lh。用PBS冲洗干净，晾干，再加抗*动物IgG荧光抗体(如羊抗兔IgG荧光抗体)，37℃孵育30min。PBS冲洗，晾干。

(3)封片：用缓冲甘油封片。

(4)观察：将片子置荧光显微镜下观察，内皮细胞的胞质呈较强的黄绿色荧光，胞核周围尤其明显。

 二、细胞冻存与复苏

 (一)细胞冻存

内皮细胞生长到一定数量时可用液氮冻存备用。步骤如下：

1．洗涤细胞  在*消化下来的细胞中加入少量培养液，离心(1000r／min，10min)，吸去上清液。

2．冻存细胞向洗涤过的细胞内加入冻存液(含10％DMSO的培养液)，使细胞浓度约为l×106／ml。将其分装于细胞冻存管中，每管1ml。把冻存管放至70℃冰箱中过夜，再将冻存管放入液氮中冻存。

(二)细胞复苏

1．融化冻存的细胞从液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水浴中并不断振摇，使其快速融化：

2．洗涤细胞将冻存管离心(1000r／min，10min)，吸去上清液，以去除DMSO。

3．培养细胞向冻存管内加入1ml培养液，吹打细胞沉淀以获得细胞悬液，移人培养瓶内，再加入．4ml培养液，使细胞浓度为3×lO5／ml。