免疫组化染色基本技术及注意事项

时间：2017/5/18阅读：515

① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。

② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面贴于同一张载片上，否则无可比性。

③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。

2.Ab稀释度 (如系购买的药盒有工作液和原液)

(1)工作液:无须稀释

(2)原液:

① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。

如:工作液浓度为1∶1000，可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验;

若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。

② 原液的保存(-20℃)冻存--应选稀度冻存。

③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存(-20 ℃)于冰箱备用。

④ 关于Ab保存应参照说明书。

(3)Ab浓度的选择

Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少;极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。--并非Ab浓度越高越好。

3.Ab滴片技术

-- 进口ELISA试剂盒所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。

滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。

要领:甩净组织周围的水。

4.PBS洗涤技术

(1)洗涤的目的

① 保证离子浓度和PH值。

② 减少非特异反应(平时Ab不可靠很纯)

(2)方法:洗三次，每次5分钟。

5.Ab孵育技术

(1)必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。

(2)温度与时间 4℃:过夜;

37℃:2 h or 参考说明书

6.进口ELISA试剂盒光镜控制显色方法

(1)室内操作:注意温度与时间的关系，室温zui宜5分钟。

(2)染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。

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