人ELISA试剂盒胸膜肺炎放线杆菌科研成果

人ELISA试剂盒胸膜肺炎放线杆菌科研成果

　　目前，胸膜肺炎放线杆菌比较难以分离，其原因有待进一步研究。本研究分离出6株APP地方分离株，人ELISA试剂盒对我国猪传染性胸膜肺炎的病原学与流行病学研究积累了一定的菌株资源。同时，对ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA两种抗体检测试剂盒进行了产业化研究，其中ApxⅣ-ELISA达到临床应用水平，对猪传染性胸膜肺炎的诊断与防控具有十分重要的意义。
    胸膜肺炎放线杆菌是引起猪传染性胸膜肺炎的病原，给养猪业带来严重的经济损失。目前共有15个血清型，该病原菌的主要毒力因子包括CPS、LPS、OMP、TBP、粘附因子、内毒素、尿素酶等。Apx毒素是APPzui主要的毒力因子，现证明不同血清型的菌株可产生4种Apx，ApxⅡ除血清型10和14以外，其它血清型都分泌；任何血清型都能在体内分泌毒素蛋白ApxⅣ，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。

本研究包括如下三方面的内容：

    1．胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定 将病料接种培养基，经过24小时的培养后将细菌进行纯化，挑单菌落革兰氏染色、镜检，将细菌接种到细菌鉴定微量反应管，同时以细菌制备模板，做apxⅣ-PCR，然后经过琼脂扩散试验确定血清型。结果从患病猪的肺、关节分离到胸膜肺炎放线杆菌6株，其中，4株4型，1株3型，1株未定型。

    2．胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA抗体检测试剂盒的研制及其应用 根据ApxⅡ的特点，实验室已经建立了一种能够监测疫苗免疫后的抗体水平和对疫苗免疫效果进行评估的血清学方法ApxⅡ-ELISA；本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒，对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试，与间接血凝试验试剂盒进行了对比研究，并用该试剂盒检测了来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清1453份，同时也制作了ApxⅡ的抗体削长规律曲线 结果表明ApxⅡ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性；三批试剂盒的批内和批间的重复性良好（变异系数均＜15％）；人ELISA试剂盒试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好；检测来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清的阳性率分别为49.56％、85.51％、1.92％、73.33％、1.85％和100％。从ApxⅡ抗体消长规律的曲线可以看出，疫苗免疫后3周或者4周就可以监测到ApxⅡ抗体，抗体水平达到峰值时，其值为1∶1280。ApxⅡ-ELISA试剂盒能够有效的诊断猪传染性胸膜肺炎，同时也可作为一种评价猪群免疫后免疫效果的有效方法；

    3．胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA抗体检测试剂盒的研制及其应用 根据ApxⅣ的特点，实验室已经建立了一种能够特异性的诊断猪传染性胸膜肺炎，并且能够有效的区分感染猪与免疫猪的鉴别诊断方法ApxⅣ-ELISA。本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒，对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试，与间接血凝试验及IDEXX公司的CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒进行了对比研究，并用该试剂盒检测了来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清1453份，同时也制作了ApxⅣ的抗体削长规律曲线。人ELISA试剂盒 结果表明ApxⅣ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性，与CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒的检测符合率为91.37％；三批试剂盒的批内和批间的重复性良好（变异系数均＜15％）；试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好；App感染后3周或者4周就可以监测到ApxⅣ抗体，抗体水平达到峰值时，其值为1∶640。检测来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清的阳性率分别为22.30％、39.72％、0.64％、42.22％、1.85％和93.94％。ApxⅣ-ELISA试剂盒能够有效区分APP感染猪与三价灭活疫苗或亚单位疫苗免疫猪。