免疫组化抗体选择及常用染色方法

免疫组化实验用抗体的选择
1、一抗选择要点
(1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。
(2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。
(3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。
(4)能否做免疫组化。一般一抗说明书都会注明做WB、IHC、ICC、IF等，建议选择注明的抗体，因为一般都是经过文章证明。
(5)检测标本类型。用于检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗体，可能都可以用来检测冰冻切片，但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。
(6)生产厂家。国外抗体生产商原装抗体质量一般没问题，尤其是美国Lifespan公司生产的IHCPlusAntibodies系列抗体，全部经过病理组织切片检测验证，100%质量保证，国内北京西美杰科技有限公司有售，就是价格有点贵；而国内分装厂家用的一抗工作液，价格便宜，但有时结果的稳定性和重复性稍差，不同批次重复性较差。
(7)价格与质量的矛盾。我个人认为一抗原装质量可能会好点，因为许多一抗避免反复冻融，且在稀释液中稳定性较差(若时间长)，但价格较贵。
2、二抗选择要点
(1)种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应；而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。这主要与后面有无三抗和三抗种类有关。
(3)选择IgM还是IgG。一般一抗是IgM，那么二抗就选择IgM；反之，一抗是IgG，则二抗选择IgG。
(4)生产厂家。一般SP三步法我们实验室选择中杉金桥的二抗染色试剂盒，内含有工作液的二抗，故试验中只需摸索一抗的浓度即可，效果还可以；而免疫荧光的二抗我一般选择Jackson ImmnoResearch公司，效果还不错。
 

免疫组化常用的染色方法有哪些
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中*——抗*染色法zui常用。
免疫组织化学染色方法 IHC染色方法有很多种，按部标记物的性质可分为荧光法(荧光素标记)，酶法(辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)，免疫金银及铁标记技术等;按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步，三步或多步法);按结合方式可分为抗原-抗体结合，如PAP法和标记的葡聚糖聚合物(labeled dextran polymer,LDP)法，以及亲和连接，如ABC法、标记的链亲和素-*(labeled streptoavidin-biotin ,LSAB)法等，其中LSAB是zui常用的使用方法。
影响免疫组化染色质量的因素很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当的选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。由于组织内待测抗原已被分解破坏，或抗原含量过低、或固定剂的使用不当及抗体质量不佳和稀释度不当等可出现假阴性反应;反之，由于抗体与非待检抗原发生交叉反应，或组织对抗体的非特异性吸附及内源性过氧化酶(endogenousperoxidase)没有被阻断等还可出现假阳性结果。这些可造成判断的失误。