198．苏州华宇牌超净工作台在茶多酚影响乳腺癌组织C-Jun 蛋白表达研究中的应用发展

1 材料

1.1 动物与细胞系：雌性BALB/c 小鼠60 只，体重（20±2）g，购自上海斯克莱实验动物有限公司[许可证号：SCXK（沪）2003-0003]，并在南京中医药大学动物中心屏障系统SPF 环境下饲养。EMT6 小鼠乳腺癌细胞购自*第四军医大学实验动物中心。

1.2 药物：茶多酚购自浙江东方茶业有限公司，纯度98％（批号：20050334）；人参皂苷Rg3（参一胶囊）每粒含人参皂苷Rg3 10 mg，购自吉林亚泰有限公司（批号：20040704）。
1.3 仪器：超净工作台系苏州市华宇净化设备有限公司生产（型号sa-cj-2FD）；离心机由上海安亭科学仪器厂生产（型号KA-1000）；莱卡倒置显微镜为德国莱卡公司产品（型号 DMIL）；Forma 恒温培养箱为美国Forma 公司产品（型号3111）。

1.4 试剂：c-jun Oncoprotein 抗体由美国CASTRATM 公司提供（批号：105205）；免疫组化超敏鼠组织试剂盒（UltraSensitiveTMS-P）购自福州迈新生物技术开发有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养与接种：EMT6 细胞用含10％ 小牛血清的RMPI1640 培养液培养，细胞长满单层后用0.25％胰酶消化，培养液吹打离心，收集细胞用PBS 稀释，浓度调至5×106，每只小鼠以0.2 ml 接种于小鼠右后背部。12 天后肿瘤长至1g 时移植。

2.2 肿瘤移植：断颈处死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3～5min 后放于超净工作台平皿中，用高压灭菌的手术器械剪开肿瘤皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤以消毒后的PBS 清洗，称重，按每克肿瘤4ml 溶液的比例用生理盐水稀释。剪碎瘤体，充分匀浆制成细胞悬液，浓度调至2×106，每只小鼠于右后背部皮下接种0.2ml。

2.3 分组及用药：接种第13 天肿瘤长至1mm3 时（成瘤48 只），随机分为4 组，即茶多酚灌胃组、茶多酚局部注射组、人参皂苷Rg3 灌胃组，模型对照组。每组12 只动物。所有给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。即：①茶多酚灌胃组：按人治疗量900mg/d 计算，换算成实验用药中剂量为11.25mg/kg，并按小鼠体重20g 计算，以2.25mg/d 配置浓度5.625mg/ml，每天灌胃0.4ml。②茶多酚局部注射组：参考茶多酚腹腔注射LD50 160mg/kg剂量，取其1/4 量为实验用小剂量组，换算成实验用药中剂量为12mg/kg，以2.4mg/d 配制浓度24mg/ml，每天局部注射0.1ml。③人参皂苷Rg3 组：按人治疗肿瘤剂量40mg/d 计算，换算成20g 小鼠剂量为0.1mg/d，配制浓度为0.25mg/ml，每天灌胃0.4ml。④模型对照组：生理盐水灌胃，每天0.4ml。在接种第13 天开始给药、给水，每日1 次，连续给药10 天。第11 天处死小鼠，取肿瘤组织制备切片待捡。

2.4 原癌基因蛋白C-Jun 检测：将肿瘤组织取出后迅速放置于10%福尔马林溶液中固定，第二天脱水，石蜡包埋，连续切片为4um 厚，其中取一张做HE 染色，其余每组选取3 个组

织切片，按相关试剂盒说明检测C-Jun 表达。用PBS 作为一抗做阴性对照。各组选取肿瘤组织3 个组织切片，每片选3 个视野，用美国TN-8502 图像分析系统作图像分析，测定光

密度（IOD）值，取其平均值，以均数±标准差（x ± s）表示。

2.5 统计方法：实验数据用SPSS11.5 计算机统计软件进行t 检验，当P<0.05 时表示差异有显著性，当P>0.05 时表示无统计意义。