1.1

蓝靛果

 [Lonicera edulis Turcz.]别名蓝靛果忍冬、蓝果忍冬、蓝果，俗称山茄子、羊奶子、黑瞎子果，为忍冬科忍冬属多年生落叶小灌木，果实为蓝色小浆果，具有很高的食用与保健价值。

1.2

植物组织培养

在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体等，培养在人工培养基和人工控制的环境中，使其再生新植株的过程和技术。（GB/T 16620）

1.3

外植体

用于植物组织培养的离体植物器官、组织、细胞以及原生质体等。

1.4

培养基

根据植物营养原理与植物组织培养的要求人工配制的营养基质。

1.5

培养基母液

按试剂种类和性质分别配制的高于培养基配方浓度的溶液。

1.6

植物生长物质

调节植物生长发育的物质，包括植物激素和植物生长调节剂。常用的植物生长物质有生长素类似物IBA（吲哚丁酸）、6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、KT（激动素）等。

1.7

外植体灭菌

将外植体表面的微生物*杀死并尽可能少伤害外植体组织和表层细胞的过程。

1.8

接种

将灭菌后的外植体在无菌条件下接入培养容器内的培养基中的过程。

1.9

诱导培养

将灭菌后的外植体接种到诱导愈伤组织等器官培养基中进行培养的过程。

1.10

继代培养

培养过程中将培养材料周期性地分株、分割等操作后，转接入新鲜培养基中继续培养的过程。

1.11

生根培养

将不定芽转移到生根诱导培养基中诱导生根，生成完整植株的过程。

1.12

移栽

组培苗在培养瓶中长出一定数量的根或根原基后，从瓶中取出移植到基质中的过程。

2　实验设备

2.1

灭菌设备

高压蒸汽灭菌锅、紫外灯。

2.2

接种设备

超净工作台、枪式镊子、眼科用解剖剪、*、酒精灯等。

2.3

培养设备

培养容器瓶（罐头瓶）、培养架、空调、照明灯管。

2.4

实验设备

电子天平（0.01mg）、冰箱、pH 5.0～7.0精密试纸、酸度计、温湿度表、照度计、烧杯、试剂瓶、量筒、容量瓶、移液枪等。

3　环境设备消毒灭菌

3.1

接种室消毒灭菌

接种前用紫外灯照射30min，每周用*及甲醛混合薰蒸。

3.2

培养室消毒灭菌

每周用*及甲醛混合薰蒸。 

3.3

超净工作台的消毒灭菌

接种前用紫外灯照射30min，并用70％酒精擦拭台面，定期清洗超净工作台过滤膜。

3.4

接种器具的消毒灭菌

使用前将枪式镊子、解剖剪、培养皿、*进行高温蒸汽消毒；接种过程中采用酒精灯灼烧消毒。

4　组培育苗

4.1

培养基制备

4.1.1

母液配制及保存

选用化学纯或分析纯的化学药品，根据MS培养基配方，分别配制大量元素（50倍）、微量元素（100倍）、铁盐（200倍）、有机物（100倍）、植物生长调节物质（0.1～0.5mg/mL）几种化合物的母液（见附件A.1和附件A.2），将母液保存在4℃的冰箱里。

4.1.2

培养基配制

根据培养基配方需求，每升培养基中分别加入琼脂粉（6.5g）、蔗糖（30g）和各类母液，依次溶解于蒸馏水，定容后用0.1mol/L HCl或0.1mol/L lNaOH溶液调节pH=5.8，定量分装至培养瓶中并封口，制备成培养基，备用。培养基配制流程见下图。

图

4.2

培养基灭菌

瓶装培养基在10h内完成灭菌，灭菌方式采用高压蒸汽灭菌，在压力0.105MPa、温度121℃条件下灭菌20min～30min。锅内的灭菌物以不超过锅的容量3/4为宜，高压灭菌时锅内使用蒸馏水。

4.3

培养基保存

灭菌后的培养基放入接种室，常温条件下7d内使用，2℃～4℃条件下14d内使用。培养基应保存于洁净环境中，注意避光和防尘。

4.4

外植体接种

4.4.1

外植体的选择

选择生长健康、强壮的植株作为采样母株，剪取母树下部的半木质化的茎段作为外植体，采样时间宜选择晴天或露水干后采集。

4.4.2

外植体灭菌

先将外植体用洗涤剂作表面清洗，清除表面的尘土，再将外植体用流水冲洗30min后，将外植体放入消毒瓶中。把装有外植体的消毒瓶放入超净工作台，在超净工作台上打开装有外植体的消毒瓶，倒入70%酒精并摇晃消毒瓶，浸泡消毒10s，倒去酒精，用无菌水冲洗外植体3次～5次；然后用0.1% HgCl2浸泡8min，无菌水冲洗3次～5次，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。

4.4.3

外植体切割

将表面消毒后的外植体切割，接入培养基中。茎在接种前用*刀剪去两端，长1.0 cm～2.0cm。

4.4.4

外植体接种

操作时，先将培养瓶的封口膜轻轻取下，放在一边，将培养瓶口在酒精灯外焰上旋转灼烧消毒，杀死瓶口的微生物。将枪式镊子在酒精灯上灼烧消毒并冷却后，将外植体接种到培养基中，每个培养瓶放3个外植体，接种后盖上封口膜，并标注日期。

4.5

组培苗培养条件

培养室的温度控制在25℃±3℃，相对空气湿度控制在70%～80%，光照强度为27μmol?m-2?s-1～36μmol?m-2?s-1，光照时间为12h/d。

4.5.1

诱导培养

将外植体接种到诱导培养基中，诱导培养基选用：MS基本培养基+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，培养20d～25d后进行继代增殖培养。

4.5.2

继代增殖培养

外植体经诱导培养生成愈伤组织或丛生芽，转接至增殖培养基中继代培养，继代增殖培养基可选用：MS基本培养基+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+KT 1.0 mg/L，培养30-35d。

4.5.3

生根培养

选取培养瓶中长度1.5cm～3.0cm生长健壮的芽接种至生根培养基中，生根培养基可选用：1/2MS基本培养基+NAA 0.5mg/L+IBA 1.0mg/L。培养25d～35d,组培苗生长过程中在基部会出现白色嫩根，25d后平均生根数3条以上，根长约在1.0cm～4.0cm。

4.6

炼苗

4.6.1

炼苗标准

当组培幼苗基部长出3条以上长1.0cm～4.0cm的新根、苗高3～8cm，即可进行炼苗处理。

4.6.2

组培苗驯化

将装组培苗的培养瓶从培养架上轻轻取下，迅速转移到日光温室中，自然散射光下炼苗，温度控制在20℃～25℃，每天中午在培养瓶周围喷洒雾水，以保湿降温，封口炼苗1d～2d。

4.6.3

开瓶锻炼

封口炼苗后打开瓶口，向瓶内注入超过培养基表面0.5cm高的自来水，温度控制在20℃～25℃，

2d～4d后即可移栽。

4.6.4

组培苗质量与分级

按照株高高矮分级，分2级，即苗高≦5cm和﹥5cm。

4.7

移栽苗

用手指或镊子轻轻取出组培苗，用清水洗去苗基部的培养基，移栽至装有黑壤土、草碳土和细河沙（混合比例为2：1：1）的混合基质的育苗盘中，育苗基质中按每立方米基质加入1kg磷酸二氢铵。育苗盘规格为35cm×50cm，育苗盘四壁高度不能低于7cm，育苗基质放入育苗容器并浇透水后，厚度应不小于5cm。

4.8

移栽苗管理

育苗期保持育苗基质见干见湿，育苗水分管理按照GB/T 6001进行。温室空气湿度应保持70%～80%，温度应在18℃～25℃。

4.9

病虫害管理

蓝靛果苗期病害主要为立枯病。主要防治方法：育苗前使用0.05%炭疽福美作药土防治，或50%多菌灵、70%甲基硫菌灵等作药土防治，每平方米用药8～9克；幼苗发病前期喷药防治，选用70%土菌消（恶霉灵）可湿性粉1000倍液，或70%甲基硫菌灵可湿性粉剂800倍液，隔周喷施，共喷两次。

虫害主要是蚂蚁。防治方法：应在育苗床周边撒一圈百虫灵等驱蚁药。

生淀粉糖化酶一般指可以直接作用、水解或糖化未经蒸煮的淀粉颗粒的酶，可能包括α-*、β*、葡萄糖*、普鲁兰酶。它可以将淀粉传统工艺中的糊化、液化和糖化合并为一步直接进行糖化，如果将其应用于无蒸煮的酒精发酵，可节约总能耗的30%~40%。已发现的能产生*的微生物种类较多，报道zui多的是黑曲霉、根霉和芽孢杆菌。本文筛选出能产生*的细菌，对其进行初步鉴定，并进行了酶学性质的研究。

1   材料与方法

1.1  土样

     校内食堂垃圾附近的土壤。

1.2  培养基

     平板分离培养基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH7.2~7.4,121℃灭菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在65℃下无菌操作加入。

液体发酵培养基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000ml，pH7.2~7.4,121℃灭菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。

1.3 菌种筛选方法

    初筛：变色圈法，选择圈径比较大的菌落，进一步划线分离后，进行产酶测定。

    复筛：测酶活，选择酶活高的菌株作为目的菌株。

1.4 生*活的测定方法

    酶活力测定方法：将发酵液在4℃，8000r/min下，离心30min后取出上清液，再通过抽滤得到的滤液为粗酶液，取1ml粗酶液，加入到19mLpH6.5的柠檬酸盐缓冲液中，再加入0.5g的可溶性淀粉为底物，30℃水解2h后用0.5ml4%的NaOH溶液终止反应，反应液在4000r/min下离心5min，用DNS法测定上清液中还原糖的含量，测定540nm处的吸光度（在酶活测定体系中，以纯水取代粗酶液作为空白），查葡萄糖标准曲线得到水解产物中的葡萄糖量，从而确定生*的酶活力大小。

酶活力定义：在pH6.5、温度为30℃保温120min条件下，1min产生1ug葡萄糖所需要的酶的量规定为1个酶活力单位（U）。

1.5 菌种鉴定

   进行形态和生理生化检测。

1.6 生淀粉糖化酶的酶学性质研究

1.6.1 酶的热稳定性研究 取一定量的粗酶液，分别在50℃、60℃、70℃和80℃不同温度下保温60min，每隔10min测定残留酶活力。

1.6.3 pH的影响  配制pH分别为3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0和8.6的柠檬酸盐缓冲液，在不同pH缓冲液中让酶水解生淀粉，通过水解产物中葡萄糖的量计算酶活力的大小。

1.6.4 酶的pH稳定性研究  将酶溶于pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中，分别放置1、2、4、6、9、12、24、36、48和60h后，测定残余物的酶活力大小。

1.6.5 金属离子的影响  以不加金属离子为对照，分别在反应液中加入1mmol/L的Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Zn2+和Cu2+，测定酶活。

2  结果与分析

2.1 菌种筛选

    从初筛平板上挑出了8株有较大淀粉水解圈的菌株，分别编号为QD001到QD008。测得它们各自的圈径比见表1，对圈径比较大的菌株QD001、QD006和QD007做斜面保藏并通过摇瓶复筛，得到QD006酶活力zui高，达到10、18U/ml，确定为目标菌株。

2.2  菌种鉴定

     QD006的菌落较小，较薄，较透明且“细腻"，边缘光滑，革兰氏染色确定该菌为革兰氏阳性菌，经显微观察呈球形，为球菌；糖类发酵试验显示改菌能利用葡萄糖，蔗糖，但不能利用乳糖：VP试验为阴性；MR试验为阴性；吲哚试验为阴性；柠檬酸盐为阴性。初步鉴定该菌为Staphylococcus intermedius。

2.3生淀粉糖化酶的酶学性质

2.3.1 温度对酶活的影响

   由图1可知，酶的zui适作用温度为50℃。当温度小于50℃时，反应速率随温度升高而升高，但高于zui适温度，酶的反应速率下降。

2.3.2 生淀粉糖化酶的热稳定性

    由图2可知，该生淀粉糖化酶在50℃和60℃时，放置1h后，残余酶活分别是99.8%和98.2%，由此可知，在60℃内，该生淀粉糖化酶具有很好的热稳定性。

2.3.3 pH对酶活力的影响

    由图3可知，该酶的zui适为6.5左右，同时可以看出pH在3-4.5的范围内，生淀粉糖化酶的酶活变化不大，上升趋势比较小，但pH对生淀粉糖化酶的影响呈现出明显的钟罩形。

2.3.4 酶的耐酸稳定性

    由图4可知，该生淀粉糖化酶在pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中放置1、2、5h后，残余的酶活力都在70%以上，随着放置时间的延长，酶活力迅速降低，放置60h，残余的酶活力仅在10%左右，所以该酶的耐酸稳定性比较弱。

2.3.5 金属离子对生淀粉糖化酶的酶活力的影响

由表2可知，Ca2+、Na+、K+、对该生淀粉糖化酶有激活作用，Fe3+、Zn2+、Cu2+ 对该酶有抑制作用。

3  结论

   从自然界分离得到产生*的菌株QD006，通过形态和生理生化鉴定，初步确定为Staphylococcus intermedius，经对该酶酶学性质的研究，其zui适温度为50℃，zui适pH为6.5，并且具有良好的热稳定性，Ca2+、Na+、K+、对该生淀粉糖化酶有激活作用，Fe3+、Zn2+、Cu2+ 对该酶有抑制作用。