1  范围

    本标准规定了食品中霉菌和酵母（moulds and yeasts）的计数方法。

    本标准适用于各类食品中霉菌和酵母的计数。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1  培养箱：28 ℃±1 ℃。

2.2  拍击式均质器及均质袋。

2.3  电子天平：感量0.1 g。

2.4  无菌锥形瓶：容量500 mL。

2.5  无菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

2.6  无菌试管: 18 mm×180 mm。

2.7  旋涡混合仪。

2.8  无菌平皿：直径90 mm。

2.9  恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。

2.10  显微镜：10×。

3  培养基和试剂

3.1  生理盐水：见附录A中A.1。

3.2  马铃薯葡萄糖琼脂：见附录A中A.2。

3.3  孟加拉红琼脂：见附录A中A.3。

4  检验程序

5  操作步骤

5.1  样品的稀释

5.1.1  固体和半固体样品：称取25 g样品，加入225 mL无菌稀释液（水或生理盐水），充分振摇，或用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的样品匀液。

5.1.2  液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品至盛有225 mL无菌稀释液（水或生理盐水）的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或无菌均质袋中，充分振摇或用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的样品匀液。

5.1.3  取1 mL 1:10样品匀液注入含有9 mL无菌稀释液的试管中，另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸，或在旋涡混合仪上混匀，此液为1:100的样品匀液。

5.1.4  按5.1.3操作程序，制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1 mL无菌吸管。

5.1.5  根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL无菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。

5.1.6  及时将20 mL～25 mL冷却至46 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼脂（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基*凝固。

5.2  培养

琼脂凝固后，正置平板，置28 ℃±1 ℃培养箱中培养，观察并记录，培养至第5 d的结果。

5.3  菌落计数

用肉眼观察，必要时可用放大镜或低倍镜，记录稀释倍数和相应的霉菌和酵母菌落数。以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

选取菌落数在10 CFU～150 CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。

6  结果与报告

6.1  结果

6.1.1　计算同一稀释度的两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数。

6.1.2　若有两个稀释度平板上菌落数均在10 CFU～150 CFU之间，则按照GB 4789.2的相应规定进行计算。

6.1.3  若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度zui高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以zui高稀释倍数计算。

6.1.4  若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度zui低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

6.1.5  若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以zui低稀释倍数计算。

6.2  报告

6.2.1  菌落数按“四舍五入”原则修约。菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告；菌落数在10～100之间时，采用两位有效数字报告。

6.2.2  菌落数大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。

6.2.3　若空白对照平板上有菌落出现，则此次检测结果无效。

6.2.4  称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。

附  录A

培养基和试剂

A.1  生理盐水

A.1.1  成分

      氯化钠                            8.5 g

      蒸馏水                           1 000 mL

A.1.2  制法

    氯化钠加入1000 mL蒸馏水中，搅拌至*溶解，分装后，121 ℃灭菌20 min，备用。

A.2  马铃薯葡萄糖琼脂

A.2.1  成分

      马铃薯(去皮切块)                  300 g

      葡萄糖                           20.0 g

      琼脂                             20.0 g

      *                            0.1 g

      蒸馏水                           1 000 mL

A.2.2  制法

    将马铃薯去皮切块，加1000 mL蒸馏水，煮沸10 min～20 min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000 mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶解，分装后，121 ℃灭菌20 min，备用。

A.3  孟加拉红琼脂

A.3.1  成分

      蛋白胨                            5.0 g 

      葡萄糖                            10.0 g

      磷酸二氢钾                        1.0 g

      *（无水）                    0.5 g

      琼脂                              20.0 g

      孟加拉红                          0.033 g

      *                            0.1 g

蒸馏水                            1 000 mL

A.3.2  制法

上述各成分加入蒸馏水中，加热溶解，补足蒸馏水至1 000 mL，分装后，121℃灭菌20 min，避光保存备用。

附  录B

霉菌直接镜检计数法

    常用的为郝氏（Howard）霉菌计测法，本方法适用于番茄酱罐头、番茄汁。

B.1  设备和材料

B.1.1  折光仪。

B.1.2  显微镜。

B.1.3  郝氏计测玻片：具有标准计测室的特制玻片。

B.1.4  盖玻片。

B.1.5  测微器：具标准刻度的玻片。

B.2  操作步骤

B.2.1  检样的制备：取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447～1.3460（即浓度为7.9%～8.8%），备用。

B.2.2  显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90～125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。

B.2.3  涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，加盖玻片，以备观察。

B.2.4  观测：将制好之载玻片置于显微镜标准视野下进行观测。一般每一检样每人观察50个视野。同一检样应由两人进行观察。

B.2.5  结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野（1.382 mm）的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即记录为阳性（＋），否则记录为阴性（－）。

B.2.6  报告：报告每100个视野中全部阳性视野数为霉菌的视野百分数（视野％）。