1  范围

本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的检验方法。

本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。

2  规范性引用文件

本标准中引用的文件对于本标准的应用是*的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其版本适用于本标准。

3  术语和定义

3.1  乳酸菌 lactic acid bacteria

    一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。

4  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

4.1  恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。

4.2  冰箱：2 ℃～5 ℃。

4.3  均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。

4.4  天平：感量0.1 g。

4.5  无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

4.6  无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。

4.7  无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。

5  培养基和试剂

5.1  MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及*锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：见附录A中A.1。

5.2  MC培养基（Modified Chalmers 培养基）：见附录A中A.2。

5.3  0.5%蔗糖发酵管:见附录A中A.3。

5.4  0.5%纤维二糖发酵管:见附录A中A.3。

5.5  0.5%麦芽糖发酵管:见附录A中A.3。

5.6  0.5%*发酵管:见附录A中A.3。

5.7  0.5%水杨苷发酵管:见附录A中A.3。

5.8  0.5%*发酵管:见附录A中A.3。

5.9  0.5%乳糖发酵管:见附录A中A.3。

5.10 七叶苷发酵管:见附录A中A.4

5.11 革兰氏染色液：见附录A中A.5。

5.12 *锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。

5.13 半*盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）：纯度＞99%。

6  检验程序

乳酸菌检验程序见图1。

7  操作步骤

7.1样品制备

7.1.1  样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

7.1.2  冷冻样品可先使其在2 ℃～5 ℃条件下解冻，时间不超过18 h，也可在温度不超过45 ℃的条件解冻，时间不超过15 min。

7.1.3  固体和半固体食品：以无菌操作称取25 g样品，置于装有225 mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，制成1:10样品匀液；或置于225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min制成1:10的样品匀液。

7.1.4  液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25 mL放入装有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。

7.2  步骤

7.2.1  用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

7.2.2  另取1 mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1 mL灭菌吸管或吸头。

7.2.3  乳酸菌计数

7.2.3.1  乳酸菌总数

根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至50℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养48 h±2 h，培养后计数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。

7.2.3.2  双歧杆菌计数

    根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至50℃的*锂盐和半*盐酸盐的MRS培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均。36℃±1℃厌氧培养48 h±2 h，培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。

7.2.3.3  嗜热链球菌计数

根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至50℃的MC培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃需氧培养48 h±2 h，培养后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2 mm±1 mm， 菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。

7.2.3.4  乳杆菌计数

    7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。

7.3  菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

7.3.1  选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

7.3.2  其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

7.3.3  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7.4  结果的表述

7.4.1  若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。

7.4.2  若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：

式中：

N——样品中菌落数；

∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——*稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（*稀释度）。

7.4.3  若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度zui高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以zui高稀释倍数计算。

7.4.4  若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度zui低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.4.5  若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以zui低稀释倍数计算。

7.4.6  若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以zui接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.5  菌落数的报告

7.5.1  菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

7.5.2  菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

7.5.3  称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

8  结果与报告

根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。

9  乳酸菌的鉴定（可选做）

9.1  纯培养

挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，置36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h。

9.2  鉴定

9.2.1  双歧杆菌的鉴定按GB 4789.34的规定操作。

9.2.2  涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5 μm～2.0 μm，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。

9.2.3  乳酸菌菌种主要生化反应见表1和表2。

附  录 A  

培养基及试剂

A.1  MRS培养基

A.1.1  成分

蛋白胨

10.0 g

牛肉粉

5.0 g

酵母粉

4.0 g

葡萄糖

20.0 g

吐温80

1.0 mL

K2HPO4·7H2O

2.0 g

醋酸钠·3H2O

5.0 g

柠檬酸三铵

2.0 g

MgSO4·7H2O

0.2 g

MnSO4·4H2O

0.05 g

琼脂粉

pH 6.2

15.0 g

A.1.2  制法

将上述成分加入到1 000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。

A.1.3  *锂盐和半*盐酸盐改良MRS培养基

A.1.3.1  *锂盐储备液制备：称取50mg*锂盐加入到50 mL蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。

A.1.3.2  半*盐酸盐储备液制备：称取250mg*锂盐加入到50 mL蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。

A.1.3.2  制法

将A.1.1 成分加入到950 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48 ℃，用带有0.22 mm微孔滤膜的注射器将*锂盐储备液及半*盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中，使培养基中*锂盐的浓度为50 mg/mL，半*盐酸盐的浓度为500 mg/mL。

A.2  MC培养基

A.2.1  成分

大豆蛋白胨           

5.0 g

牛肉粉

3.0 g

酵母粉

3.0 g

葡萄糖

20.0 g

乳糖                         

20.0 g

碳酸钙

10.0 g

琼脂

15.0 g

蒸馏水

1 000 mL

1％中性红溶液

pH6.0

5.0 mL

A.2.2  制法

将前面7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节pH，加入中性红溶液。分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。

A.3  乳酸杆菌糖发酵管

A.3.1  基础成分

牛肉膏

5.0 g

蛋白胨

5.0 g

酵母浸膏

5.0 g

吐温80

0.5 mL

琼脂

1.5 g

1.6%溴甲酚紫酒精溶液

1.4 mL

蒸馏水

1 000 mL

A.3.2  制法

按0.5%加入所需糖类，并分装小试管,121 ℃高压灭菌15 min～20 min。

A.4七叶苷培养基

A.4.1 成分

蛋白胨

5.0 g

*

1.0 g

七叶苷

3.0 g

枸橼酸铁

0.5 g

1.6%溴甲酚紫酒精溶液

1.4 mL

蒸馏水

100 mL

A.4.2  制法

将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，121 ℃高压灭菌15 min～20 min。

A.5革兰氏染色液

A.5.1  结晶紫染色液

A.5.1.1  成分

结晶紫

1.0 g

95％乙醇

20 mL

1％草酸铵水溶液

80 mL

A.5.1.2  制法

将结晶紫*溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

A.5.2  革兰氏碘液

A.5.2.1  成分

碘

1.0 g

*

2.0 g

蒸馏水

300 mL

A.5.2.2  制法

将碘与**行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待*溶解后，再加蒸馏水至300 mL。

A.5.3  沙黄复染液

A.5.3.1  成分

沙黄

0.25 g

95％乙醇

10 mL

蒸馏水

90 mL

A.5.3.2  制法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

A.5.4  染色法

A.5.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。

A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。

A.5.4.3 滴加95％乙醇脱色，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

A.5.4.4 滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。