1  范围

本标准规定了食品用双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定及计数方法。

本标准适用于食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一的双歧杆菌菌种的鉴定；以及食品中仅含有双歧杆菌属的计数，双歧杆菌属可包含一种或多种不同的双歧杆菌菌种。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1  恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。

2.2  冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3  天平：感量0.1 g。

2.4  无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

2.5  无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸头。

2.6  无菌培养皿：直径90 mm。

3  培养基和试剂

3.1  双歧杆菌培养基：见附录A.1。

3.2  PYG培养基：见附录A.2。

3.3  甲醇：分析纯。

3.4  三氯甲烷：分析纯。

3.5  冰乙酸：分析纯。

3.6  乳酸：分析纯。

3.7  乙酸标准溶液：吸取分析乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。

3.8  乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。

4  检验程序

双歧杆菌的检验程序见图1。

图1  双歧杆菌的检验程序

5  操作步骤

5.1  无菌要求：全部操作均应遵循无菌操作程序。

5.2  食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数

5.2.1  鉴定

5.2.1.1  接种：半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。真空冷冻干燥菌种，先加适量灭菌生理盐水，溶解菌粉，然后接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。

5.2.1.2  涂片镜检：双歧杆菌为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢、无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。

5.2.1.3  生化鉴定：挑取5.2.1.1步骤中的平板上生长的单个菌落，进行生化反应检测。双歧杆菌的过氧化氢酶试验为阴性。不同双歧杆菌菌种的主要生化反应见表1。

5.2.1.4  气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物（可选项），见附录B.1。

5.2.2  计数

5.2.2.1  样品的稀释

5.2.2.2.1  取1.0 g固体菌种溶解于9.0 mL生理盐水或其它稀释液，制成1:10的样品匀液。

5.2.2.2.2  用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有9.0 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

5.2.2.2.3  另取1 mL无菌吸管或吸头，按5.2.2.2.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，即换用1次1 mL灭菌吸管或吸头。

5.2.2.2.4  根据对样品双歧杆菌浓度的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1.0 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1.0 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

5.2.2.2.5  及时将 15 mL～20 mL冷却至 46 ℃的双歧杆菌琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

5.2.2.2  培养

待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。

5.2.2.3  菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落

形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

5.2.2.3.1  选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

5.2.2.3.2  其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

5.2.2.3.3  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

5.3  食品中双歧杆菌的鉴定及计数

5.3.1  鉴定

5.3.1.1  称重取样25.0 g，或体积取样25.0 mL，置于装有225 mL稀释液的灭菌锥形瓶内，制成1:10的样品匀液。

5.3.1.2  将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。

5.3.1.3  纯培养

挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。

5.3.1.4  涂片镜检：参照5.2.1.2。

5.3.1.5  生化鉴定：参照5.2.1.3。

5.3.1.6  气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物，参照5.2.1.4。

5.3.2  计数

5.3.2.1  同5.3.1.1步。

5.3.2.2  稀释步骤  参照5.2.2.1。

5.3.2.3  菌落计数  参照5.2.2.3。

6  报告

6.1  鉴定

根据5.2.1.2项镜检、5.2.1.3项生化鉴定，报告双歧杆菌属的种名。根据5.2.1.4项乙酸与乳酸微摩尔之比，报告双歧杆菌的有机酸代谢产物。

6.2  计数

6.2.1  菌落计数的计算方法和报告：参照GB 4789.2《食品微生物学检验 菌落总数测定》中的7.1和7.2。

6.2.2  称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。