前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。

　　1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

　　双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实*没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。

　　纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒

　　酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA*分解的酶量定义为1个活性单位（U）。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切*切得动。

　　2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

　　摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

　　pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（Xpmoles×长度bp×650）/1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为

　　0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

　　测DNA浓度可以在机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。

　　连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350U/μl，所以*够用。连接酶容易失活，注意低温操作，在冰上。时间3个小时足已。

　　3、转化：

　　a、全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

　　b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

　　c、加入890μlAMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。

　　取100μl铺板。也可离心后余100μl

　　几个非常重要的问题

　　1做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.

　　2对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干

　　3对照的设立：

　　为验证双酶切是否成功,可做如下对照:

　　A酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.

　　做转化时,也要进行对照.

　　设4个:

　　A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.

　　B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒

　　C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.

　　D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.

　　4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事zui后却更费事.注意设立对照。

　　经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。