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上海博湖生物科技有限公司
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更新时间：2023-10-26 21:06:42浏览次数：731
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R5421 感受态细胞100ul*10 操作方法（以下操作均按无菌条件的标准进行）
1 取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。
● 一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。
以下实验以100 μl感受态细胞为例。
R5421 感受态细胞100ul*10 2 向感受态细胞悬液中加入目的DNA（100 μl 的感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30 分钟。
3 将离心管置于42℃水浴中放置60-90 秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3 分钟，该过程不要摇动离心管。
4 向每个离心管中加入900 μl 无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素）， 混匀后置于37℃摇床振荡培养1 小时（160-220 转/分钟），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
R5421 感受态细胞100ul*10 5 将离心管内容物混匀，吸取100 μl 已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB 或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16 小时。
● 涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA 总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA 总量较少，可取200-300 μl 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4,000 rpm, 2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）
注意事项
1. 感受态细胞应保存在 -70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。
2. 进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。
3 为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到低。
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