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对药品中杂质的控制是保证药品用药安全的重要环节. 伴随着对药品杂质特性的深入了解, 依据杂质的生理活性逐一制定每一个杂质限度的“杂质谱控制"理念已经被国内外普遍接受. 与“杂质谱控制"相关的关键技术问题可概括为: 复杂体系样本的分离分析、微量组分的结构分析和微量组分的毒性评价三方面 .安徽省药物结构确认及杂质分析-CMA资质
安徽省药物结构确认及杂质分析-CMA资质
品中杂质的控制是保证药品用药安全的重要环节. 伴随着对药品杂质特性的深入了解, 依据杂质的生理活性逐一制定每一个杂质限度的“杂质谱控制”理念已经被国内外普遍接受. 与“杂质谱控制”相关的关键技术问题可概括为: 复杂体系样本的分离分析、微量组分的结构分析和微量组分的毒性评价三方面. 本文从杂质控制理念和杂质分析技术两方面, 综述了化学药品杂质控制的现状, 并就今后的发展提出自己的观点.
3.1.2 药品有关物质分析的现状
按杂质谱控制的理念, 在药品质量标准中, 要求所采用的分析方法不仅能分离出样品中实际存在的杂质, 且能分离出各类潜在的杂质, 并对分离出的主要杂质能进行定性, 以便根据其来源和生理活性制定不同的质控限度. 纵观各国药典的发展, 利用反相HPLC 系统分析有关物质已成为药品质量控制的主流. 通过与BP、EP 和USP 方法的比较, 确定HPLC 方法[24~28]是目前国内进行杂质分析方法修订
的主要内容. 通过努力, 在ChP(2010)中几乎所有的抗生素品种(包括原料和制剂)均采用HPLC 方法, 多数采用梯度洗脱实现对有关物质的控制; 且对β-内酰胺抗生素、喹诺酮抗生素、大环内酯类和氨基糖苷类抗生素等已经报道的各类杂质, 采用杂质对照品、混合杂质对照品, 结合相对保留时间、LC-MS 等方法,在HPLC 色谱图中进行归属, 并制定相应的质控限度,其中数十种杂质已经通过杂质对照品等方法实现了单独控制. 对大环内酯类和氨基糖苷类多组分抗生素, 如*中的*A、*B与*C; 他霉素中的组分A9、A8、A7、A6、A5、A4、A1、A3 和A13; *中的*A1、他霉素A6 及其他他霉素A 系列组分(A1、A2、A4、A6、
A8); 乙酰*的四个主要活性组分; 硫酸*中的四个C 组分含量及其中的*、西索米星和其他的未知组分等, 也已经通过HPLC 方法分别对其主组分、无效、未知组分分别实现了控制. 上述工作使得我国对化学药品中杂质的控制水平与国外接近.对微量毒性杂质的控制是国内杂质控制的热点.例如对引发β-内酰胺抗生素过敏反应的聚合物类杂质的控制. 1994 年Hu CQ 等[29]利用Sephadex G10 凝胶*对多种β-内酰胺抗生素中的高分子杂质进行了分析. ChP(2005)采用该方法*对多个*、*中的高分子杂质进行了控制. 但在以后的实践中, Sephadex G-10 凝胶色谱柱效低、分离效果差等缺点逐步暴露[30]. 利用高效凝胶色谱法可以克服Sephadex G-10 凝胶色谱系统的部分不足. Cai SY等[31]利用Superdex Piptide 凝胶实现了对*中聚合物的分析; 顾立素等[32]利用TSK2500 PWXL 凝胶实现了对*钠/*片中*聚合物的分析; 此外, 利用柱切换技术, 在反相HPLC系统中定位聚合物杂质, 可以实现聚合物杂质分析和其他有关物质分析的统一[33]. 在ChP(2010)中, 虽然仍有多个β- 内酰胺抗生素采用葡聚糖凝胶Sephadex G10 色谱系统控制其聚合物含量, 但高效凝胶TSK2000 色谱系统已经用于对*钠聚合物的控制; 且通过对*钠、*钠、*钠/*、*钠/*及其制剂中二聚体的控制, 实现了利用“指针性杂质”对β-内酰胺抗生素聚合物类杂质进行控制的目的, 解决了凝胶色谱法测定聚合物易受干扰的问题. 这也将主导今后对β-内酰胺抗生素聚合物的分析. 此外, 粉针剂胶塞中释放出的抗氧剂2,6-叔丁基-4-基-*(BHT)可以与*钠等*发生缔合反应并导致药品的溶液澄清度下降[34], 豚鼠被动皮肤过敏试验(PCA)显示,*钠溶液的混浊程度与其引发过敏反应的强弱密切相关(未发表资料), 因此关注注射用*粉针剂与胶塞相容性研究中的杂质变化及与药品安全性的相关性是目前国内杂质研究的另一热点.如何保证杂质分析方法的有效性是杂质谱分析的另一关键. 对没有特征紫外吸收的化学药如氨基糖苷类抗生素, 虽然国外更倾向采用电化学检测器分析杂质, 但国内大量的研究报道表明, 采用HPLC-ELSD 检测亦能满足质控要求[35~40]. 在ChP(2010)中采用HPLC-ELSD 控制氨基糖苷类抗生素的杂质已经成为主流. 近年来, 作为HPLC 分析方法的有效补充, 采用高效毛细管电泳(HPCE)法[41, 42]和高效薄层色谱(HPTLC)法[43]分析药物中杂质的报道日益增多[44, 45]. HPCE 不仅在对手性杂质的分析方面[46, 47], 且在对药物中其他杂质的分析方面[48, 49]已突显优势. 胶束毛细管电泳法可有效分离药物的各类同分异构体, 如*的R、S 异构体、顺反异构体和Δ异构体, 且较区带电泳具有更强的杂质分离能力(未发表资料). 在保持HPCE 分析重现性方面也已取得较大进展[50]. 但由于HPCE 的检测灵敏度较低, 因此更适合作为反相HPLC 方法的互补验证方法. 如能采用二维色谱相关光谱技术[51]实现HPLC 与HPCE 色谱系统中色谱峰的相互识别, 将真正实现利用不同原理的分离方法分析药物中杂质的目标.
3.2 微量组分的结构分析
按ICH 要求, 对原料药中含量大于0.1%的杂质需要进行结构鉴定. 能否快速的鉴别出药品中杂质
的结构, 关系到 “杂质谱控制”理念应用的成败. 虽然采用传统的分离制备技术分离杂质, 再利用各种波谱学方法解析杂质的结构, 仍然是鉴别药物中杂质, 特别是结构相对复杂的药品的有效方法, 如抗癌新药XP315[52]、*(linezolid)[53]、*[54]等, 但其效率极低, 这种研究模式对于分析“量少且不稳定的杂质”存在缺陷和困难. 而采用高分辨质谱推测可能结构, 再结合必要的波谱学分析, 是目前杂质结构分析的常用策略, 如对西酞普兰(citalopram)[55]、依普罗沙坦(eprosartan)[56]、沙曲硝唑(satranidazole)[57]、*(rizatriptan)[58]等药品中杂质的分析; 通过分析工艺中可能产生的杂质, 再通过反合成技术合成各种杂质, 也是可行的方案, 如对*(indomethacin)[59]、*(valsartan)[60]等药品中杂质的分析.近年来, 中检所致力于发展一套“分析杂质来源,推测杂质结构, 采用LC/MS 等技术验证推测结构”的杂质快速鉴别方案, 希望根据杂质的来源, 产生条件,结合药物母核的质谱裂解规律和杂质的产生原理推断杂质结构, 并取得了一定的成功.在鉴定未知同系物结构方面, 利用紫外光谱图获取母核结构的信息; 通过一级质谱获取分子量信息,二级质谱获取碎片峰信息, 进而推测有关各取代基的情况; 再根据色谱保留行为来验证所推测结果的正确性. 采用此策略, 结合对十六元环大环内酯类抗生素MS 裂解规律的探讨[61], 已经成功鉴别出他霉素(kitasamycin)[62]、乙酰他霉素(acetylkitasamycin)[63]、*(meleumycin)[64]及国产一类新药可利霉素(kelimycin)[65] (利用基因工程技术将碳霉素4″-异戊酰转移酶(4"-O-acyltransferase)基因克隆到*产生菌中, 在微生物体向酰化*(spiramycin, SPM) 得到的以4″- 异戊酰*(4"-isovalerylspiramycin, ISV-SPM)为主组分的十六元环多组分大环内酯类抗生素)中的诸组分结构. 利用氨基糖苷类抗生素的MS 裂解规律[66], 对*[36]、阿司米星[37]、*[38]、西索米星[39]等多个氨基糖苷类抗生素中的杂质及国产一类新药依替米星中的诸杂质进行了较好的归属(未发表资料).对于反应机理已知的降解杂质, 首先根据反应原理设计加速实验, 再通过一级质谱获取分子量信息, 二级质谱获取碎片峰信息, 并利用UV 特征和色谱保留行为来验证所推测的结果, 必要时可通过NMR 对杂质的结构进行确证. 我们已经对β-内酰胺类抗生素的MS裂解规律进行了系统的总结[67], 并利用此策略成功地对*[68]、*二钠等*中的主要降解杂质进行了鉴别. 该策略在对法罗培南[69]、*[31]、*[70]、蒜氨酸[71]、*[72]等主要降解杂质的结构鉴定中也得以验证.对于MS 裂解规律尚不十分明确的药物, 则主要依据其合成工艺, 推测合成中可能出现的各类副产物, 并通过反合成的方法合成这些杂质, 再利用LC/MS 的质谱和色谱保留值信息确定产品中是否含有该杂质. 采用此策略, 我们已成功地对*和多种喹诺酮药物包括国产一类新药安妥沙星中的杂质进行了归属.结合国家重大新药创制项目中“创新药物研究开发技术平台建设”等国家项目的实施, 中检所正在汇同有关单位进一步丰富各类药物的MS 裂解数据库,并在此基础上研究同系物药品杂质的裂解规律, 进而形成更完善的杂质鉴别策略.
3.3 微量组分的活性评价
在实现“杂质谱控制”的三个必需关键技术中,对微量杂质组分的毒性评价是薄弱的环节. 按ICH的规定[1], 当化学原料药中的杂质含量大于0.15%时,应当对其限度的合理性进行评估(qualification). 当缺乏足够的生物学实验数据时, 定量结构性质/活性相关(QSPR/QSAR)分析方法可以用来初步评价、预测化合物的危险性. 国内的结构-毒性的关系研究主要集中在对环境污染物的研究. 如应用电拓扑状态指数(electrotopological state indices, E-state indices)预测有机污染物的理化性质和毒理学性质[73]; 采用原子类型电拓扑指数(ETSIAT)为结构描述子, 研究脂肪醇毒性的定量构效关系(QSAR)[74]; 应用理论线性溶剂化能关系(TLSER)模型探讨35 种有机磷酸酯类(OP)化合物的结构及其对家蝇急性毒性的关系[75], 应用基因表达式编程探讨88 种醛类化合物分子结构与大鼠急性毒性的定量构效关系[76]; 周鲁等对*类抗生素[77]、喹诺酮类药物[78]的定量构动关系(QSPR)进行了探讨; 这些研究方法对探讨微量杂质组分的毒性评价具有重要的借鉴作用. 甘慧等综述了几类代表性化合物结构产生反应性代谢产物的情况,包括苯醌亚胺、噻吩环、氮翁离子、环氧化物、硫脲等, 试图从代谢角度揭示药物分子结构与药物毒性之间的关系[79]; 林叶新等对苯甲酸等14 种食品防腐剂及叔丁基对苯二酚等6 种食品抗氧化剂的大鼠急性经口毒性[Log(LD50)]与其化学结构的关系进行了探讨[80];提示对药品中杂质组分的毒性评价已经引起关注.但如何将对杂质组分的毒性评价与杂质的质控限度
相关联-危险度评估的研究尚较少见. 毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern, TTC)原则作为一项新的危险度评价原则, 已相继被多个组织认可和采纳,并成功应用于评价食物中低水平暴露的化学物质和调味料等物质的毒理学安全性[81]. 应用TTC 决策树评估药物杂质组分的危险度, 有望帮助制定出更合理的杂质质控限度.近年来, 斑马鱼作为一种新的优秀模式动物已受到愈来愈多的关注, 已被广泛地用于胚胎发育学、基础医学和药学领域的研究. 利用斑马鱼进行药物毒理学评价具有*的优越性[82~84]; 不仅可以进行药物急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性的研究, 还可以评估药品的靶器官毒性及毒性机制[85, 86]. 目前, 中检所正在与中国医学*医药生物技术研究所合作, 利用斑马鱼的胚胎毒性模型, 通过与药物活性成分毒性的比较, 评价药物杂质组分的危害性, 并已取得进展.
4 需要进一步关注的问题
实施杂质谱控制的基本策略汇总于图3. 在药品国家标准中按“杂质谱控制”的理念对药品中的杂质进行控制是杂质控制的终目标, 而对杂质结构的推断则是杂质研究/控制过程中的核心环节. 每年上发表有大量的与药品杂质相关的文献, 但由于文献中采用的杂质分析系统通常与药品标准中的色谱系统不同, 且一般无法得到相应的杂质对照品,故无法直接利用文献结果归属药品标准方法中分析到的杂质结构. 我们正在利用化学计量学方法, 希望
图3 实施杂质谱控制的基本策略
借助于杂质的UV 光谱及MS 裂解谱, 利用色谱相关光谱/质谱裂解谱技术, 解决不同色谱系统中杂质的相互识别/追踪问题[51, 87, 88]; 并正在进行杂质对照品的数字化研究, 将杂质对照品的定性信息(色谱保留值参数、UV、MS 和NMR 参数)和定量信息(杂质校正因子(normalization factor))形成数据库, 逐步建立起国家药品标准数字化杂质对照品库, 这将加速在国家药品标准中实施“杂质谱控制”的步伐, 提高国内新药研发、仿制的水平.
涉及地区：广东省药物结构确认及杂质分析、浙江省药物结构确认及杂质分析、福建省药物结构确认及杂质分析、海南省药物结构确认及杂质分析、云南省药物结构确认及杂质分析、广西省药物结构确认及杂质分析、贵州省药物结构确认及杂质分析、新疆省药物结构确认及杂质分析、四川省药物结构确认及杂质分析、重庆市药物结构确认及杂质分析、西藏省药物结构确认及杂质分析、湖南省药物结构确认及杂质分析、江西省药物结构确认及杂质分析、湖北省药物结构确认及杂质分析、上海市药物结构确认及杂质分析、北京市药物结构确认及杂质分析、天津市药物结构确认及杂质分析、安徽省药物结构确认及杂质分析、江苏省药物结构确认及杂质分析、甘肃省药物结构确认及杂质分析、宁夏省药物结构确认及杂质分析、内蒙古省药物结构确认及杂质分析、黑龙江省药物结构确认及杂质分析、吉林省药物结构确认及杂质分析、辽宁省药物结构确认及杂质分析、山东省药物结构确认及杂质分析、陕西省药物结构确认及杂质分析、山西省药物结构确认及杂质分析、河南省药物结构确认及杂质分析、河北省药物结构确认及杂质分析
安徽省： 合肥市药物结构确认及杂质分析、 毫州市药物结构确认及杂质分析、 芜湖市药物结构确认及杂质分析、 马鞍山市药物结构确认及杂质分析、 池州市药物结构确认及杂质分析、 黄山市药物结构确认及杂质分析、 滁州市药物结构确认及杂质分析、 安庆市药物结构确认及杂质分析、 淮南市药物结构确认及杂质分析、 淮北市药物结构确认及杂质分析、 蚌埠市药物结构确认及杂质分析、 巢湖市药物结构确认及杂质分析、 宿州市药物结构确认及杂质分析、 宣城市药物结构确认及杂质分析、 六安市药物结构确认及杂质分析、 阜阳市药物结构确认及杂质分析、 铜陵市药物结构确认及杂质分析、 明光市药物结构确认及杂质分析、 天长市药物结构确认及杂质分析、 宁国市药物结构确认及杂质分析、 界首市药物结构确认及杂质分析、 桐城市药物结构确认及杂质分析、
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