酵母双杂交(Yeast Two Hybrid, Y2H)可分为核蛋白体系酵母双杂交和膜蛋白体系酵母双杂交，两种体系大致原理相同。以下为大家分别介绍：
 

　　1、核体系酵母双杂交技术原理
 

　　核蛋白酵母双杂交主要原理是基于酵母转录激活因子GAL4由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成。其中N端的147个氨基酸组成GAL的DNA结合结构域(DNA binding domain, BD)，负责与基因上游的激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合；C端的113个氨基酸组成GAL的转录激活结构域(transcription activation domain,AD)，负责激活UAS下游的基因转录过程。BD与AD在单独存在时无法激活UAS下游基因转录，只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥完整的转录因子功能，激活UAS下游基因的表达，使得菌落能够在缺陷培养基中的生长情况或者通过显色反应进行显色。例如当报告基因为LacZ时，在培养基中加入显色底物X-Gal，当BD与AD同时存在时，LacZ正常表达，生成β-半乳糖苷酶，将X-Gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4氯靛蓝，使得菌落呈现蓝色。
 

图 酵母GAL4转录激活示意图
 

　　在进行酵母双杂实验时，将已知的诱饵蛋白X与BD结构域融合表达；捕获蛋白Y与AD结构域融合表达。若蛋白A和蛋白B存在互作，则BD和AD在空间上会靠近，成为有活性的转录激活因子，激活下游报告基因表达；若蛋白A和蛋白B不存在互作，则BD和AD在空间上较远，单独无法发挥转录激活作用，报告基因不表达。酵母文库构建和筛选则是将捕获蛋白更换为蛋白文库，构建融合表达AD结构域的文库质粒，并形成酵母文库，从而利用酵母双杂交系统筛选与诱饵蛋白A存在相互作用的未知蛋白。
 

图酵母双杂交原理示意图
 

　　2、膜体系酵母双杂交技术原理
 

　　膜蛋白酵母双杂交主要原理是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的DUAL membrane系统。该系统主要利用泛素(Ubiquitin,Ub)作为26S蛋白酶体降解蛋白标签的特性，可分为N端(1-37个氨基酸NubI结构域，通常将第13位liangansuan突变为ganansuan或者binansuan(NubG)以降低与Cub的自重组)和C端(35-76个氨基酸Cub结构域)，当NubG和Cub相互靠近时，能够发挥标签功能，通过泛素修饰目标蛋白，使目标蛋白被泛素介导的蛋白酶体途径识别并剪切。基于该原理，将Cub末端添加转录因子形成Cub-TF，在NubG与Cub-TF靠近后，可以将TF剪掉并进入细胞核，激活报道基因表达。
 

　　在进行膜体系酵母双杂交实验时，将诱饵蛋白X和猎物蛋白Y分别构建到Cub-TF载体和NubG载体，如果X和Y存在相互作用，则Cub-TF和NubG相互靠近，将TF进行泛素标记并被泛素特异性蛋白酶UBPs识别剪切后释放并进入细胞核，激活报告基因表达。
 

图 膜蛋白酵母双杂交原理示意图
 

　　技术优势
 

　　基于报告基因表达产物累积效应，检测灵敏度高；
 

　　以报告基因为检测对象，可用于检测弱蛋白相互作用或者瞬时相互作用；
 

　　无需抗体或者蛋白纯化操作；
 

　　相对其他方法，成本较低；
 

　　技术缺陷
 

　　由于部分基因具有自激活效应，因此可能存在假阳性；
 

　　一定程度可以模拟生理互作，但与哺乳细胞仍有一定区别；
 

　　外源蛋白可能对酵母具有毒性，抑制酵母生长，干扰实验结果；
 

　　Y2H技术流程
 

　　1、酵母感受态细胞制备
 

　　PS：经费充足的小伙伴可以直接购买商用感受态细胞，省时省力，经费稍显紧张的小伙伴就只能按照以下步骤付出人力成本啦。
 

　　(1)取- 80℃保存的酵母菌株涂布到YPDA培养基平板，28℃倒置培养4-7 d；
 

　　(2)挑取单克隆菌落加入到10 mL YPDA液体培养基中，30℃，250 rpm条件下震荡培养至OD600 = 1.4-1.8，并逐步扩大培养至50-100 mL；
 

　　(3)待菌株生长至合适密度时(OD600 = 0.6-0.8)，收集菌液，1000 g转速下室温离心5 min，收集细胞沉淀；
 

　　(5)加入50 mL无菌超纯水(或者生理盐水)重悬酵母细胞进行洗涤；
 

　　(6)1000 g转速下室温离心5 min，收集细胞沉淀；
 

　　(7)加入3 mL 1.1 × TE/LiAc重悬酵母细胞进行洗涤；
 

　　(8)重悬的酵母细胞等体积转移至新的离心管，6000 g转速下室温离心30 s；
 

　　(9)收集沉淀并加入适量1.1 × TE/LiAc重悬酵母细胞，分装至100 μL/管，-80℃保存备用。
 

　　2、酵母转化
 

　　(1)取出酵母感受态细胞，分别加入10 μL ssDNA，0.1 μg质粒，PEG/LiAc 600 μL，涡旋混匀。(PS: ssDNA作用类似于鲑鱼精DNA，避免质粒在转入真核细胞中被降解。）
 

　　(2)30℃水浴30 min，加入70 μL DMSO；
 

　　(3)42℃热激15 min，冰上冷却2 min；
 

　　(4)2000 g转速下室温离心10 s，弃上清；
 

　　(5)加入1 mL无菌水(或者生理盐水)重悬沉淀；
 

　　(6)吸取200 μL转化混合物涂布到营养缺陷型培养平板中；
 

　　(7)28℃倒置培养2-4 d，观察菌落生长情况。
 

图 酵母双杂交实验流程示意图(图片来源于网络)
 

　　由于酵母双杂交系统可能存在自激活现象(与BD结构域结合的诱饵蛋白具有转录激活活性，在BD结合UAS序列后无需AD结构域即可激活下游报告基因表达；或者与BD结构域结合的诱饵蛋白与酵母内源具有转录激活活性的蛋白互作，激活下游报告基因表达)。为保证酵母双杂交实验结果的真实可靠性，在进行实验时通常设置阴性对照组和阳性对照组、自激活组以及实验组等(以核体系酵母双杂交为例)。
 

　　阴性对照组：pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT；
 

　　阳性对照组：pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT；
 

　　自激活组：pGBKT7-X + pGADT7；
 

　　实验组：pGBKT7-X + pGADT7-Y；
 

　　对照组(可选)：pGBKT7 + pGADT7；pGBKT7 + pGADT7-Y；
 

　　酵母双杂交实验时通常使用SD/ -Trp/ -Leu二缺培养板，用于验证质粒转化效果；SD/ -Trp/ -Leu/ -His三缺培养板，用于验证是否存在自激活；SD/ -Trp/ -Leu/- His/ -Ade为四缺培养板，用于主要验证互作结果。
 

酵母双杂交结果示意图(图片参考网络绘制)
 

　　如上图所示，在二缺板中，所有分组均有菌落，说明质粒转化成功。
 

　　pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT组为阴性对照，由于Lam和ADT不存在互作，无法激活下游报告基因表达，因此在三缺板和四缺板中均未出现菌落；
 

　　pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT组为阳性对照，由于P53与ADT存在互作，BD和AD靠近，激活下游报告基因表达，因此在三缺和四缺板中长出菌落；
 

　　pGBKT7-X + pGADT7为自激活组，若蛋白X没有转录激活活性或者不存在具有转录激活活性的酵母内源蛋白与X互作，则三缺板和四缺板中无法长出菌落；若存在自激活现象，则在三缺板和四缺板中长出菌落；
 

　　pGBKT7-X + pGADT7-Y为实验组，由于蛋白X和蛋白Y存在相互作用，因此能够激活下游报告基因表达，可在三缺和四缺板中长出菌落。
 

　　PS：如果在培养板中加入X-gal，则在进行酵母双杂交实验时，阳性菌落因表达报告基因LacZ，将X-gal切割将成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4氯靛蓝，使得菌落呈现蓝色；这也是为什么有些文章酵母双杂交实验菌落颜色为蓝色。
 

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