研究团队开发了一种基于Cas12a的多重核酸检测系统CASTI，CASTI系统通过互补序列阻断报告DNA（探针）来调节Cas12a的反式裂解活性，该系统能实现单反应、单Cas效应蛋白、两个靶标基因的同时检测。作者结合重组酶聚合酶扩增（RPA）和转录反应，准确且高灵敏度地同时检测低至1 aM的HPV 16和18靶标，验证了CASTI平台的可行性。

发表在Biosensors and Bioelectronics期刊上的论文“Cas12a/blocker DNA-based multiplex nucleic acid detection system for diagnosis of high-risk human papillomavirus infection”，开发了一种基于Cas12a的多重核酸检测系统CASTI，该系统能实现单反应、单Cas效应蛋白、两个靶标基因的同时检测。该系统实现了在只有Cas12a单一效应蛋白的单一反应管中对高危HPV的快速多重检测，是一种用户友好且经济的基于Cas系统的多重核酸检测替代方案。

基于CRISPR/Cas12a对ssDNA底物的反式切割活性高于dsDNA底物的特性，作者提出了基于单一CRISPR/Cas12a系统的多重核酸检测策略：无靶标存在时，报告DNA（探针）与阻断剂DNA互补，形成“报告探针-阻断剂”dsDNA结构（R/B），抑制Cas12a/crRNA/activator三元复合物行使反式裂解活性，产生可忽略的荧光信号；靶标存在时，靶标与阻断剂DNA结合，报告DNA（探针）以ssDNA的形式释放，并被激活的Cas12a/crRNA/activator三元复合物反式剪切，产生高荧光信号（图1a）。

R-CASTI的检测原理为：RPA反应（靶标特异性识别与放大），T7 RNA聚合酶以RPA产物为模板进行转录，生成HPV 16和HPV 18 的RNA产物，靶标RNA产物分别与HPV 16和HPV 18的阻断剂正交结合，并释放相应单链报告探针（图3）。Cas12a反式裂解报告探针，产生强烈的FAM和Cy5信号。

作者评估了R-CASTI系统在最佳条件下对HPV 16或18的检测灵敏度和检测特异性。通过对不同HPV类型的L1基因进行多序列比对，作者选定了分别被HPV 16和18引物特异性识别的位点1和2（图4a）进行实验。作者使用R-CASTI系统和选定的RPA引物集，检测了不同浓度的HPV 16或18存在时的荧光信号。R-CASTI系统高灵敏检测HPV 16和HPV 18（图4 b-c)，检测限（LOD）为1 aM（约0.6 拷贝/μL）。R-CASTI系统能有效地区分低靶标浓度，如100 aM和1 fM。然而，单独使用RPA法则无法实现这种区分。这说明R-CASTI系统比RPA法具有更高的检测灵敏度（图4d）

作者探究了R-CASTI系统在多重核酸检测中的可行性。作者首先优化了activator的浓度（6 nM），然后，使用R-CASTI系统在单管中同时检测HPV 16和18。HPV 16和18的存在分别特异性地产生了FAM和Cy5荧光信号，且没有产生非特异性荧光信号（图5a）。通过检测不同浓度的HPV 16和HPV 18下的FAM和Cy5荧光信号，作者确定了R-CASTI系统的LOD为1 aM（图5b）。这一结果优于或可与其他基于CRISPR/Cas的多重检测系统相媲美，这证实了R-CASTI系统在多重核酸检测中的高灵敏度。最后，作者使用3种细胞系（Jurkat：HPV16-/18-；CaSki：HPV16+/18-；和HeLa：HPV16-/18+）来验证R-CASTI对人类基因组DNA（gDNA）中高危HPVs的有效检测。结果显示，Jurkat细胞系没有出现FAM或Cy5信号，CaSki细胞系只产生FAM信号，HeLa细胞系只产生Cy5信号（图5c）。上述检测结果与核酸检测的金标准qPCR的检测结果一致，证实了R-CASTI系统的可靠性（图5d）。