Hypoxyprobe, Inc.(缺氧探针公司)专注于研发非侵略性的缺氧标志物(Hypoxia maker)和缺氧依赖性的细胞因子，所有产品皆基于Pimonidazole核心结构来开发。使用Pimonidazole HCl作为缺氧标记物，广泛用在狗、大小鼠。缺氧探针试剂盒核心组分为：缺氧探针(Pimonidazole 或CCI-103F)和缺氧探针的抗体。不同试剂盒中的探针和抗体标记不同。(可应用于免疫荧光(IF)，免疫组化(IHC)，WB或流式细胞分析(FC))
 

　　1.问：什么是 pimonidazole HCl(Hypoxyprobe-1)的最佳溶剂？
 

　　答：pimonidazole HCl 是弱碱 pimonidazole 的盐酸盐，在水溶液中非常易溶，包括中性缓冲盐水(116 mg/mL 或 400 mmol)。这允许在动物研究中使用小体积(0.1-0.5 mL)进行腹腔内或静脉注射 pimonidazole HCl。
 

　　2.问：用于缺氧标记的 pimonidazole HCl 剂量应该是多少？
 

　　答：pimonidazole HCl 在缺氧组织中的结合程度将取决于生物还原激活的速率以及组织对 pimonidazole HCl 的接触程度(接触 = 浓度 x 时间)。还原代谢的速率很难预测，但可以检查接触的影响。在以下计算中，浓度以 pimonidazole HCl(分子量 290.7)为单位给出。
 

　　体外接触于 58mg/kg(培养基中的浓度)1 小时的球状体观察到强烈的缺氧染色。接触 = 58mg/kg x 1 小时 = 58mg/kg-小时。
 

　　在人体中，使用 0.5gm/m2(约 14mg/kg)的剂量可以获得肿瘤组织和正常上皮中的强染色，其中 pimonidazole 的血浆半衰期为 5 小时。接触 = 14 mg/kg x 5 小时 = 70 mg/kg-小时。
 

　　在小鼠肿瘤组织中，使用 60 mg/kg 可以获得缺氧的强染色，其中 pimonidazole 的血浆半衰期为 0.25 小时。接触 = 60mg/kg x 0.25 小时 = 15 mg/kg-小时。
 

　　总结来说，对于体型统一的小动物，如实验室大鼠和小鼠，推荐使用 60 mg/kg 体重的 pimonidazole HCl 剂量，这是效果和经济性之间的良好平衡。在小鼠和大鼠中使用了 30 mg/kg 至 400 mg/kg 的剂量，没有毒性或由于血流效应导致的氧气水平改变，但使用超过 100 mg/kg 的 pimonidazole 剂量时，观察到在小鼠后腿植入的肿瘤中出现血流效应。因此，在使用后腿肿瘤模型时，剂量 > 100 mg/kg 必须小心。对于体型不均匀的较大动物，剂量通常基于表面积计算。对于人类，推荐剂量为 0.5 gm/m2，而狗的使用剂量为 0.28 gm/m2。
 

　　3.问：Hypoxyprobe-1 是否能穿透缺氧的大脑和脑肿瘤组织？
 

　　答：尽管 Hypoxyprobe-1 是水溶性的，但其相应的游离碱(pimoindazole)具有 8.5 的辛醇-水分配系数，因此该标记物可以自由穿透大脑和脑肿瘤组织。
 

　　大鼠脑肿瘤冰冻切片的免疫荧光染色。大鼠脑肿瘤冰冻切片的免疫荧光染色。血管：ME 9F1；红色。缺氧：Pimonidazole 加合物；绿色。灌注：Hoechst 33342；蓝色。正常大脑(N)和肿瘤组织(T)。原始放大倍数为 x 200。注意正常大脑中血管的规则模式与肿瘤组织中血管的无序排列(Bernsen et al, Journal of Neurosurgery 93: 449-454, 2000; by permission)。
 

　　4.问：pimonidazole HCl 是检测体内缺氧的最佳探针吗？
 

　　答：pimonidazole HCl，即“金标准”免疫组化缺氧标记物，具有真正的优势，包括高水溶性(在盐水中为 116 mg/mL)，允许以小体积注射 ip 或 iv 给药。像六氟化 CCI-103F 这样的标记物水溶性为 10 毫摩尔或更低，通常作为 ip 花生油和 DMSO 的乳液给药，以避免血液稀释。
 

　　固体 pimonidazole HCl 在室温或 4°C 下非常稳定(多年)。在 4°C 下避光保存的 pimonidazole HCl 浓缩水溶液也非常稳定(多年)。小鼠和兔子对 pimonidazole 加合物的抗体在 4°C 下保存至少一年稳定。
 

　　小鼠中 pimonidazole 的 LD50(7天) 为 728 mg/kg，将其归类为低毒性的非危险品。
 

　　尽管 pimonidazole HCl 非常水溶性，但作为游离碱的 pimonidazole 具有 8.5 的高辛醇-水分配系数，并且容易穿透所有组织，包括大脑。实际上，它在大多数组织中的积累比血浆水平高 3 倍，使其有效的组织浓度远高于其他 2-硝基咪唑缺氧标记物。
 

　　Pimonidazole 的结合可以通过多种技术检测，包括：冷冻固定组织切片中的免疫荧光；福尔马林固定石蜡包埋组织切片中的免疫过氧化物酶染色；ELISA；或流式细胞术。
 

　　5.问：单克隆抗体对 pimonidazole 加合物是否可以用于小鼠组织？
 

　　答：是的。对于福尔马林固定石蜡包埋的组织，我们推荐使用过氧化物酶 F(ab)2 二级抗体策略(见产品手册)，它提供了非常干净的背景，适用于多种动物物种。
 

　　6.问：pimonidazole HCl 激活和结合到缺氧细胞的机制是什么？
 

　　答：Varghese et al.表明，缺氧细胞将 2-硝基咪唑结合到肽硫醇，如guguanggantai。目前对 pimonidazole 代谢的看法总结在下面的方案中。O2 与 pimonidazole 的第一个电子的添加竞争，这解释了激活和结合的 pO2 依赖性。根据试管实验，估计大约 20% 的活化 pimonidazole 结合到细胞硫醇上，大约 80% 不结合但通过与水的反应而断裂。Pimonidazole 受氧化代谢的影响，导致容易排泄的 N-氧化物、硫酸盐和葡萄糖醛酸衍生物(ST = 硫酸转移酶；GT = 葡萄糖醛酸转移酶)。这些氧化途径似乎不影响 pimonidazole 作为缺氧标记物的效用。
 

　　7.问：Hypoxyprobe 试剂盒中提供的 IgG1 抗体浓度是多少？
 

　　答：Hypoxyprobe-1 试剂盒中提供的耗尽杂交瘤溶液中小鼠 IgG1 单克隆抗体的浓度约为 60 ug/mL。
 

　　Hypoxyprobe-1 Plus 试剂盒中的 FITC 偶联 MAb；Hypoxprobe-1 Green 试剂盒；Hypoxyprobe-1 Red549 试剂盒；Hypoxyprobe-1 RedAPC 试剂盒；和 Hypoxyprobe-1 Biotin 试剂盒中的亲和纯化 IgG1 的浓度约为 500 ug/mL。
 

　　亲和纯化的兔子抗血清对 pimonidazole 加合物和未纯化的兔子抗血清对 Hypoxyprobe-F6(CCI-103F)加合物中的活性 IgG 分子的浓度未知。
 

　　8.问：pimonidazole 结合是否能检测慢性和急性缺氧？
 

　　答：在固体组织中发生两类缺氧 - 扩散限制的慢性缺氧和灌注限制的急性缺氧。慢性缺氧出现在由靠近血管的细胞消耗氧气而产生的氧梯度的远端，肿瘤的情况是由血管树中的 pO2 纵向梯度引起的局部氧气供应不足而加剧的( Dewhirst et al., Temporal changes in pO2 of R3230AC tumors in Fischer-344 rats, Int J Radiat Oncol Biol Phys 42: 723-726, 1998)。慢性缺氧的存在意味着组织中的细胞以与氧气供应无关的速率消耗氧气，从而在远离血管的微小区域将 pO2 推向非常低的水平。也就是说，大多数细胞具有“调节”的细胞表型特征，通过平稳过渡到基于糖酵解的能量产生而适应低 pO2(Dewhirst et al., Temporal changes in pO2 of R3230AC tumors in Fischer-344 rats, Int J Radiat Oncol Biol Phys 42: 723-726, 1998)。
 

　　与具有静态、代谢控制的 pO2 梯度的慢性缺氧相比，急性缺氧与由血流不稳定性引起的 pO2 波动相关，肿瘤的情况是由短暂的血管阻塞造成的。急性缺氧的肿瘤细胞，由于是增殖的，可能比静止的、慢性缺氧的细胞在治疗上更相关。在正常组织中，波动的缺氧与缺氧再灌注损伤相关。关于 pimonidazole 是否能检测到慢性和急性缺氧，结合弱碱性取代基(pKa ≥ 8.0)的化合物在组织中浓缩约 3 倍于循环血水平。弱碱性化合物的这种性质是基于细胞内外 pH 差异对弱碱性化合物细胞内浓度的影响。特别是，在 pH 7.4 时，弱碱性 2-硝基咪唑在细胞内的浓度比细胞外浓度高 2 倍。这种浓度增加直接反映在缺氧细胞的放射增敏和用缺氧标记物标记的增加上。因为经历波动缺氧的细胞靠近血管并且 pH 相对较高，弱碱性、2-硝基咪唑缺氧标记物如 pimonidazole 在这些细胞中浓缩，因此急性缺氧发作导致与缺乏弱碱性官能团的缺氧标记物相比，结合水平更高。通过这种方式，pimonidazole 及其类似物在检测急性缺氧方面更youyue(Kleiter, et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion and literature cited)。
 

　　9.问：在 pimonidazole HCl 给药后多久可以收获感兴趣的组织？
 

　　答：在收获过程中组织变得缺氧，循环中的 pimonidazole 结合可能会在原则上给出缺氧的错误测量。答案在于比较标记和收获期间组织对 pimonidazole 的接触程度。接触(pimonidazole 浓度 x 37°C 下的时间)在标记期间很大，在收获期间非常短，因为 pimonidazole 浓度限于收获时组织中的浓度。低标记浓度、快速收获和立即在冷介质中固定将消除可测量的非特异性结合水平。
 

　　在人类肿瘤研究中，活检通常在 pimonidazole HCl 输注后 16-24 小时进行。人类中 pimonidazole 的血浆半衰期约为 5 小时，因此 16 到 24 小时代表循环 pimonidazole 的 3 到 5 个血浆半衰期。这意味着在收获时 pimonidazole 的初始浓度为 1/8 到 1/32。这与活检材料快速转移到冷固定剂相结合，最小化了非特异性 pimonidazole 结合，如大多数靠近血管的细胞的低背景结合所示。
 

　　在一些人类肿瘤研究中，活检在 pimonidazole HCl 输注后 1.5 到 4 小时进行，并立即在液氮中固定。这种方法也给出了靠近血管的细胞的低背景结合。尽管在输注后 1.5 到 4 小时循环中的 pimonidazole 水平相对较高，但收获的组织中对 pimonidazole 的接触与体内标记期间对 pimonidazole 的接触相比非常短。
 

　　人类肿瘤的经验可以指导实验研究。小鼠中 pimonidazole 的血浆半衰期通常为 0.25 小时。在这种情况下，收获时间为 1-2 小时，与快速加入冷固定剂相结合，有效地消除了非特异性结合。这一结论对于涉及二氧化碳窒息的实验尤为重要，因为全局缺氧的持续时间定义不清。更快速的anlesi技术适用于较短的收获时间，只要进行快速组织收获并在冷固定剂中固定。
 

　　10.问：为什么将 pO2 阈值 ≤ 10 mmHg 设置为 pimonidazole 结合的基础？
 

　　答：在固体组织中测量 2-硝基咪唑结合的 Km(O2) 是困难的。迄今为止zuihaode实验是 Gross 等人。在固体组织球状体模型中，通过放射自显影测量放射性标记的 misonidazole 结合，与氧微电极测量的 pO2 进行比较。由于 misonidazole 结合导致的颗粒密度在 10 mm Hg 以下急剧增加(Gross et al. Calibration of misonidazole labeling by simultaneous measurement of oxygen tension and labeling density in multicellular spheroids, Int. J. Cancer 61: 567-573, 1995)。Chou 等人发现 pimonidazole 结合的 Km(O2) 与 HeLa 细胞中的 misonidazole 类似，并得出结论，10 mm Hg 也是固体组织中 pimonidazole 结合的合理阈值(Chou et al. Evidence that involucrin, a marker for differentiation, is oxygen regulated in human squamous cell carcinomas. Br. J. Cancer, 90: 728-735, 2004)。
 

　　固体组织的一个特征在稀疏的细胞培养中是不存在的，即氧气消耗创造了非常陡峭的 O2 梯度，以至于不同 Km(O2) 被穿越的距离被缩短。例如，在肝组织中观察到陡峭的 pO2 梯度，其中 pimonidazole 加合物的免疫染色从背景到强烈染色仅跨越几个细胞直径。与组织中存在陡峭的 pO2 梯度一致的是，氧气调节蛋白如 involucrin 和碳ic anhydrase IX 的免疫染色模式与 pimonidazole 结合的模式非常相似，尽管氧气调节蛋白的 Km(O2) 约为 15 mm Hg，而体外 pimonidazole 结合的 Km(O2) 为 2-4 mm Hg(Chou et al. Evidence that involucrin, a marker for differentiation, is oxygen regulated in human squamous cell carcinomas. Br. J. Cancer, 90: 728-735, 2004 for further discussion)。
 

　　11.问：体内 N-氧化是否会影响 pimonidazole 作为缺氧标记物？
 

　　答：pimonidazole 中的哌啶基团很容易被氧化成其 N-氧化物代谢物。原则上，这可能会影响 pimonidazole 作为缺氧标记物的有效性。(Arteel et al. Reductive metabolism of the hypoxia marker pimonidazole is regulated by oxygen tension independent of the pyridine nucleotide redox state. Eur J Biochem, 253: 743-750, 1998 for a detailed discussion of the metabolism of pimonidazole)。在体内，pimonidazole N-氧化物是通过黄素单加氧酶(FMO)的作用形成的。FMO 同工酶的分布因物种而异，产生不同的 N-氧化物血浆水平。有趣的是，pimonidazole 给药的途径(iv 或口服)对 N-氧化物的血浆水平影响很小(Kleiter et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion)。像过氧亚硝酸盐这样的强氧化剂，由超氧阴离子与一氧化氮(NO)反应形成，也可以氧化 pimonidazole。然而，N-氧化物的形成似乎并没有损害 pimonidazole 作为缺氧标记物的有效性。
 

　　首先，N-氧化物的形成可以通过血液中的血红蛋白-铁复合物的还原作用以及组织还酶如huangpiaoling脱氢酶和还原型细胞色素 P-450 来逆转，从而限制了 pimonidazole 因氧化而丢失(Walton et al. The reversible N-oxidation of the nitroimidazole radiosensitizer Ro 03- 8799. Biochem Pharmacol, 34: 3939-3940, 1985)。
 

　　其次，通过使用第二种缺氧标记物，已经表明 pimonidazole 标记的缺氧程度与推荐用于缺氧标记的 pimonidazole 血浆浓度无关。
 

　　第三，因为 pimonidazole 及其 N-氧化物衍生物对 anti-pimonidazole 抗体没有交叉反应性，N-氧化物不会干扰缺氧组织中 pimonidazole 加合物的检测(Kleiter et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion)。
 

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