fumeiA（CoA）在所有形式的细胞生命中都是通用且*的辅因子，在许多生物合成，产生能量和降解的途径中充当主要的酰基载体。它在脂肪酸的合成和氧化，丙酮酸的氧化和柠檬酸循环中起重要作用。CoA的测量是研究许多生物系统中生物过程和事件的基本任务之一。有几种试剂或测定试剂盒可用于定量生物系统中的CoA含量。但是，现有的商用套件要么缺乏灵敏度，要么具有繁琐的程序。我们的Amplite™荧光CoA定量分析试剂盒提供了一种超灵敏的荧光分析方法，可通过检测CoA中的-SH基团来定量CoA含量。试剂盒中使用的我们专有的荧光CoA Green™染料在与-SH反应时会发出强烈的荧光。该分析试剂盒在100 µL分析体积（40 nM）中仅能检测到4 piCoole。它可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，无需分离步骤即可轻松实现自动化。

1. 准备CoA标准品或测试样品（50 µL）

2. 加入CoA工作溶液（50 µL）

3. 在室温下孵育10分钟-1小时

4. 监视Ex / Em = 490/520 nm处的荧光增加

重要说明
开始实验之前，请在室温下解冻所有试剂盒组件。

储备溶液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。避免重复冻融循环。

1. CoA标准溶液（1 mM）：
将200 µL ddH ₂ O加入CoA标准样品瓶（组分C）中，制成1 mM（1 nmol / µL）储备液。注意：强烈建议使用充满氮气的ddH ₂ O除去氧气，以制备fumeiA标准溶液。水溶液不稳定，会迅速降解。应将其保存在2-8°C并在一天之内使用。

2. CoA Green™储备溶液（100X）：
将100 µL DMSO（组分D）添加到CoA Green™（组分A）小瓶中，制成100X储备溶液。

配制标准溶液

为了方便起见，请使用我们的系列稀释计

将30 µL CoA标准溶液添加到970 µL测定缓冲液（组分B）中，以生成30 µM（30 pmol / µL）CoA标准溶液。取30 µM CoA标准溶液（CoA7），用测定缓冲液（组分B）进行1：3连续稀释，以获得CoA标准溶液（CoA1-CoA6）的连续稀释液。注意：稀释的CoA标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

准备工作溶液

将50μL的CoA Green™储备溶液（100X）加入5 mL的测定缓冲液（组分B）中并充分混合。

程序

表1.黑色96孔微孔板中CoA标准品和测试样品的布局。CoA =fumeiA标准品（CoA1-CoA7，0.03至30 µM）；BL =空白对照；TS =测试样品。

表2。每个孔的试剂组成。

1. 根据表1和2中提供的布局，准备fumeiA标准品（CoA），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂代替50 µL。
   

2. 将50 µL CoA工作溶液添加到CoA标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，以使总CoA分析体积为100 µL /孔。对于384孔板，请向每个孔中添加25 µL CoA工作溶液，总体积为50 µL /孔。
   

3. 避光保存，室温下孵育反应10分钟至1小时。
   

4. 使用荧光板读数器监测Ex / Em = 490/520 nm处的荧光增加。

数据分析

1e+41000100101010.1- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Coenzyme A (uM)RFUX: 0.0188Hover mouse to interactY: 2.995Y: 2.995

从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。从其他标准的读数中减去该值即可得到基线校正值。然后，绘制标准读数，以获得标准曲线和方程式。该方程式可用于计算fumeiA样品。