基质金属蛋白酶（MMP）构成了一族依赖锌的内肽酶，在细胞外基质中发挥作用。这些酶负责结缔组织的分解，在骨骼重塑，月经周期和组织损伤修复中很重要。虽然很难评估MMP对某些病理过程的确切贡献，但MMP似乎在关节炎的发展以及癌症的侵袭和转移中起着关键作用。MMP倾向于具有多种底物，大多数家族成员具有降解不同类型胶原蛋白以及弹性蛋白，明胶和纤连蛋白的能力。很难找到对单个MMP酶具有选择性的底物。该FRET底物经设计对MMP-3具有较高的选择性。它用于监视MMP-3活动。当使用纯化的MMP-3酶时，它也可用于筛选MMP-3抑制剂。该FRET基板基于我们的TF2 / TQ2 FRET对。在MMP-3水解后，由于TF2 / TQ2 FRET对已分离，因此MMP-3 Green™FRET肽底物的荧光增强。荧光增加与MMP-3酶活性成正比。

平台

组件

协议范例

乍看上去

协议摘要

1. 添加适当的对照或测试样品（50 µL）
2. 预孵育10-15分钟
3. 添加MMP-3 Green™底物工作溶液（50 µL）
4. 跳过孵育以获取动力学读数，或孵育30至60分钟以获取终点读数
5. 监测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

重要说明
开始实验之前，请在室温下解冻所有试剂盒组件。根据需要准备包含MMP-3的生物样品。

准备工作溶液

1. MMP-3 Green™底物工作溶液：
将50μLMMP-3 Green™底物（组分A）添加到5 mL的测定缓冲液（组分C）中，使总体积为5.05 mL。

2. MMP-3稀释：
如果使用纯化的MMP-3，则在测定缓冲液（组分C）中将MMP-3稀释至适当浓度。注意：  MMP-3需要在使用前激活。避免酶剧烈涡旋。

3.抑制剂和化合物的稀释：
如果要筛选MMP-3抑制剂，请根据需要适当调配已知浓度的MMP-3抑制剂和测试化合物稀释液。

程序

表1.在96孔微孔板中适当的对照（根据需要）和测试样品的布局。SC =底物对照，IC =抑制剂对照，VC =载体对照，TC =测试化合物对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成。注意：某些强荧光测试化合物可能会导致假阳性结果。

1. 根据需要准备包含MMP-3的生物样品。

2. 要激活pro-MMP-3，请先用1：500的测定缓冲液（组分C）稀释1M APMA（组分B），以获得2 mM APMA工作溶液（2X）。注意： APMA属于有机汞。小心轻放！请按照当地法规进行处理。
   
   接下来，将含有MMP-3的样品或纯化的MMP-3与等体积的2 mM APMA工作溶液（2X）在37°C下孵育24小时。在实验之前立即激活MMP-3。注意：将含酶的样品放在冰上。避免剧烈涡旋酶。活化酶的长时间储存​​将使酶失活。为了酶的活化，优选以较高的蛋白质浓度活化。激活后，您可以进一步稀释该酶。

3. 根据表1和2中提供的布局准备对照和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用20 µL试剂代替50 µL。

4. 如果要筛选MMP-3抑制剂，请在所需的酶反应温度（例如25°C或37°C）下将板预孵育10-15分钟。
    
5. 将50 µL（96孔）或20 µL（384孔）的MMP-3 Green™底物工作溶液添加到样品和测定板的对照孔中。充分混合试剂。
    
6. 使用荧光板读数器在Ex / Em = 490/525 nm处监控荧光强度。
   
   对于动力学读数：立即开始测量荧光强度，并每5分钟连续记录数据30至60分钟。
   
   对于终点读数：将反应在室温下孵育30至60分钟，如果可能，请避开光线。充分混合试剂，然后测量荧光强度。