产品描述

        Single Cell Squence Specific Amplification Kit是基于一步RT-PCR的预扩增方法，适用于单细胞或者微量总RNA中转录组的扩增，便于进行单细胞转录组表达差异的分析。本试剂盒实现了RNA提取纯化、逆转录和PCR预扩增反应在同一管内完成，不需要额外的操作，简单高效，还能减少实验误差和污染风险。除了应用于单细胞，本试剂盒亦可适用于2~1,000个细胞的一步扩增，应用时仅需按照细胞数目减少一步扩增的循环数；获得的扩增产物适合于任何实时荧光定量PCR分析法。染料法和探针法qPCR分别推荐ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal, #22204)和2 × Q3 probe qPCR Master Mix (Universal, #22205)。

 产品优势

✽ 一步法RT-PCR预扩增：细胞裂解、RNA逆转录和PCR扩增在同一管内完成，不需要额外的移管操作。
✽ 一次可扩增500个靶基因：扩增产物适合用任何实时荧光定量PCR仪分析。

 实验案例

        分别使用ToloBio #22121与竞品Supplier A、Supplier B，对不同浓度的小鼠巨噬细胞进行一步法RT-PCR预扩增，产物进一步qRCR（ToloBio #22204）扩增，比较在相同引物和相同细胞个数条件下的扩增情况，包括扩增灵敏度、扩增线性和扩增平台。结果显示，ToloBio #22121在不同浓度细胞（1～1000个细胞/test）条件下扩增性能稳定、优异。

 实验流程

1.Primer Pool的制备
        将不同待测基因的扩增引物进行混合，制备成Primer Pool，使各引物的终浓度为0.1 μM。以Bcl-2基因为例，其上、下游引物原浓度均为100 μM，则应各取1 μL加入998 μL RNase-free ddH2O至终体积为1 mL。多个基因引物对的制备依此类推，最多可混合500对不同基因的扩增引物。

2.预扩增反应体系
        在RNase-free离心管中冰上配制如下反应体系：

a.细胞可储存于PBS缓冲液中。
以上体系（除细胞样本外）充分混匀后冰上放置备用，可加入1~1000个细胞样本。为了使细胞充分破碎，将加入细胞样本的完整体系置于-80℃冰箱2 min，随后3,000 rpm (1,000 × g)室温或4℃离心2 min，然后立即放入PCR仪进行如下反应：

b.建议循环数随起始细胞数量作相应调整：1个细胞20个循环，10个细胞17个循环，100个细胞14个循环，1,000个细胞11个循环。 
反应结束后，每管加入20 μL RNase-free ddH2O (1:5稀释)，用移液器吹打混匀，室温短离集于管底。可立即进行后续qPCR定量反应或-20℃短期保存。

3.qPCR反应体系
冰上配制如下反应体系：

c.为减少加样误差，建议将1:5稀释的预扩增产物再稀释10倍后使用。

以上体系充分混匀后，短暂离心集于管底，随后立即放入qPCR仪进行如下反应：

 产品组成

d.包含 dNTP；
e.包含RTase、RNase inhibitor和Taq DNA polymerase；

保存条件

-20℃保存，≤ 0℃运输；