蛋白质的定量分析主要依靠蛋白质本身的发色基团,或与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行的。目前常用的蛋白质的定量主要有紫外线吸收法、Bradford法及BCA法等。
实验原理:BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸)法测定蛋白的原理 二价铜离子在碱性条件下可以被蛋白质还原成一价铜离子(biuret reaction),一价铜离子和du特的BCA溶液A(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子,形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性,吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系,并于标准曲线对比,因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
实验材料:
1.试剂A 含1%BCA二钠盐溶液、2% 无水Na2CO3溶液、0.16%酒石酸钠溶液、0.4%氢氧化钠溶液、0.95% NaHCO₃溶液,将上述液体混匀后调PH至11.25。
2.试剂B 4%硫酸铜溶液。
3.BCA工作液 按50体积试剂A加1体积试剂B(50:1),配制适量BCA工作液,充分混匀。
4.蛋白质标准液
(1)储存液配制:准确称取50mg牛血清白蛋白,溶于10ml蒸馏水或PBS中,即为5mg/ml的蛋白标准液储存液。
(2)工作液:取储存液10ul稀释至100ul,使终浓度为0.5mg/ml。
实验仪器:
主要仪器酶标仪是分光光度计的另一种形式;光电检测器将待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号,电信号经前置放大、对数放大、模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算。
实验方法:
1、制作标准曲线:参照标准配制蛋白质溶液及蛋白质标准曲线绘制。
2、各孔加入200ul BCA 工作液,37℃培养箱放置15~30min。用酶标仪测定A562nm,根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时,应注意防止因水分蒸发影响检测结果。