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Bst 4.0 Basic Mix (液体预混)

该制品为单一组分的 MasterMix（2 倍浓度），包含了反应缓冲液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用时只需要加入引物、模板即可进行核酸恒温扩增。Bst4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依赖于 RNA 模板的聚合酶活性（逆转录），还具有依赖于 DNA 的聚合酶活性，因此无论DNA 或 RNA 样本均可使用该制品进行高效的恒温扩增。该制品是进行 LAMP 及 RT-LAMP 扩增反应的试剂。优化的反应体系，确保快速的完成检测试剂的反应体系建立。该系列产品不包含任何其它辅助染料，在 LAMP 的扩增搭配 OG 橙绿变色管进行可视化变色反应。除此外，该制品还可以用于其它恒温扩增实验，包括 CPA、SMAP 等。
储存：长期保存制品于-20℃，保存 2 年。
使用实例（以 LAMP OG 橙绿变色为例）橙绿变色染料（OG Dye）以冻干的形式预加在 8 联管盖上。在 LAMP 反应完毕后（在反应完毕前，务
必不能将管盖上染料混入反应液中），将 0.2ml EP 管颠倒溶解 OG 染料后。LAMP 的反应产物将与 OG 染料形成强烈的绿色肉眼可见变色反应（阳性），而未发生扩增的 EP管为深橙色（阴性）。
（1）配制反应体系
在 0.2ml EP 反应管中加入下述试剂
2xBst 4.0 Basic Mix 10 μl
*10xLAMP Primer Mix 2 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 20 μl
*10xLAMP Primer Mix 浓度：FIP/BIP 分别为 16 μM、LoopF/B 分别为 4 μM、F3/B3 分别为 2 μM全部试剂加入完毕后，轻弹 EP 管底部后，再盖上 OG 橙绿变色管（盖上管盖后务必不能再剧烈混合与倒置，以防止将管盖上的 OG 染料溶解，OG 染料一旦混入反应液中将会终止 LAMP 反应）。
实验 LAMP Primer Mix 分别采用 1、1.5、2 μl，以阴性不变色，阳性样品正常变色为标准，作为后续测试用量。
（2）反应体系配好后，置于 60~68°C（实验采用65°C）进行反应 20~45min。（扩增良好的引物组合，通常 25min 即可变色，一般不超过 45min，实验设置20、25、30、45min）。
（3）观察结果：观察结果时，尽可能不要与配制反应空间共用，以防止污染操作台。将反应 EP 管倒置，并手腕轻甩，反应液浸泡 EP 管盖上的 OG 染料，静置 30s。再将 EP 反应管正置，并轻甩反应液到 EP 管底部，此时扩增样品将变为鲜艳肉眼可见绿色，而阴性未发生扩增的管将为深橙色。
注意事项
1. 在用于其它恒温扩增反应时（如 CPA、SMAP 等），可参考如上策略进行使用，反应时间可能会需要调整。
2. 关于矿物油的使用，在配制完 LAMP 反应体系后，可加入一滴矿物油覆盖于反应液上部，以减少气溶胶的污染。
3. 鉴于特殊的生产工艺， 全系恒温扩增 Mix 系
列均不能进行浊度分析。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。