测定多种凋亡标志物的实验-----TUNEL测试法

时间：2023/7/12阅读：59

活化的核酸内切酶引起的核小体间 DNA 断裂被普遍认为是细胞凋亡的生化标志。含有这些 DNA 链断裂的细胞可以通过末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记(TUNEL)分析来鉴定。这种成熟的原位染色方法依赖于酶末端脱氧核苷酸转移酶(tdT)催化修饰的 dUTPs 与片段化 DNA 的3’-羟基末端的结合。根据修饰的 dUTP-BrdUTP，生物S -dUTP 或荧光素 -dUTP- 凋亡细胞的选择，可以使用各种检测策略和系统(包括荧光显微镜，流式细胞术和基于荧光的微板研究)来鉴定和测量。百萤提供了几种荧光 TUNEL 分析方法，优化后用于在活细胞或固定细胞和组织样品中原位检测细胞凋亡。这些产品可以与其他基于细胞的活力和细胞凋亡测定相结合，以提供细胞健康的全面评估，评估候选药物的毒性和安全性，或分析癌症和疾病相关的细胞变化。

1.TUNEL分析原理

在细胞凋亡的后期阶段，半胱天冬酶激活的核酸内切酶将基因组 DNA 切割成寡核小体片段(约180-200碱基对长)。使用 TUNEL 测定，这些断裂暴露的3’-OH 末端可以用修饰的 dUTPs 标记，以便随后在原位显示和定量凋亡细胞。这通常是直接使用染料修饰的 dUTP 或间接使用 BrdUTP 和抗 BrdUTP 的抗体偶联物来完成的。无论采用何种标记策略，两者都需要酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化修饰的 dUTPs 与3’-OH 末端的结合。

图1.固定化细胞和组织 TUNEL 凋亡显像检测细胞凋亡。

用这种方法检测 DNA 片段需要使用交联试剂如4% 多聚甲醛(避免使用乙醇为基础的固定剂，因为它阻碍了小片段的提取)和样品透化等样品固定。这两个步骤对 TUNEL 检测是至关重要的，因为它促进了外源性 TdT 和抗 BrdUTP 抗体偶联物的进入。记住几个变量影响 TUNEL 分析的染色动力学。其中一些变量，包括试剂浓度、样品固定和 DNA 链断裂的可及性，可能因组织或细胞样品类型而异。使用具有阳性和阴性凋亡控制样品的 TUNEL 检测标准化可以减轻这些潜在的影响并减少假阳性或阴性结果。

2.活细胞的TUNEL分析

传统上，TUNEL 分析需要样品的固定和透化，以促进外源性 TdT 的进入，并确保 DNA 链断裂的成功标记。虽然对结果至关重要，这种额外的处理需要额外的手的时间和条件的优化，所以结果是准确的和可重复的。细胞计数器活细胞 TUNEL 细胞凋亡测定的目的是确定 DNA 片段没有酶 TdT 和额外的处理，随之而来的使用。这些检测利用了一种专有的膜透性荧光染料，它被动地进入活细胞，并选择性地靶向在细胞凋亡过程中形成的 DNA 缺口。荧光标记的 DNA 片段可以通过荧光显微镜、流式细胞术或基于荧光的微板分析直接观察到。Cell MeterTM Live Cell TUNEL 细胞凋亡测定以两种发射颜色(绿色和红色)可用于其他基于荧光的细胞功能测定(例如半胱天冬酶活性测定和膜联蛋白 V 染色测定)的多参数分析中的灵活性。

TUNEL测试法2.png

TUNEL测试法2.1.png

TUNEL测试法2.2.png

与未处理的对照相比，用100nM 或1μM 星形孢菌素(SS)处理4小时的 HeLa 细胞中 TUNEL 反应的荧光图像。将细胞与 TUNEL 工作溶液在37 °C 下温育1小时。红色荧光信号用 TRITC 滤波器组的荧光显微镜进行分析。荧光标记的 DNA 链断裂显示强烈的荧光染色 SS 处理的细胞。

3. 固定细胞和组织样品的TUNEL分析

按照传统的TENL方法,对固定细胞和组织的测定结果进行了优化。 在原地 固定细胞和组织切片细胞凋亡的检测。这些实验通过使用TDT催化在片段DNA3'-OH端的染色修饰荷兰蛋白的结合,直接识别群体中的凋亡细胞。荧光标记的DNA片段可以分别用荧光显微镜或流式细胞仪进行可视化或定量化。细胞仪中的固定细胞和组织TINL细胞凋亡检测可以用四种发射颜色(蓝色、绿色、红色和深红色)进行灵活的多参数分析,例如其他荧光蛋白或共轭,例如河豚素 .