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1.百萤 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性细胞凋亡复用检测试剂盒概述
我们的Cell Meter 检测试剂盒是一套用于检测细胞生存力的工具。 有多种参数可用于检测细胞活力。 胱天蛋白酶被广泛认为是细胞凋亡的可靠指标。 该特定试剂盒设计为使用三种不同的荧光色同时监视与细胞凋亡有关的四个关键半胱天冬酶（caspase-3 / 7、8和9）。 该试剂盒使用DEVD-ProRed，IETD-R110和LEHD-AMC作为分别指示caspase 3 / 7、8和9活性的荧光指示剂。 在半胱天冬酶裂解后，DEVD-ProRed ，IETD-R110和LEHD-AMC半胱天冬酶底物会产生三种不同的荧光团：ProRed （红色荧光），R110（绿色荧光）和AMC（蓝色荧光）。
2.百萤 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性细胞凋亡复用检测试剂盒适用仪器
荧光酶标仪
Ex(nm) 见表一
Em(nm) 见表一
推荐孔板 黑色透明底板
读取模式 底部/顶部读取
Caspase | 荧光 | 激发光线(Ex) | 发射光线(Em) |
Caspase3/7 | 红色 | 535nm | 620nm |
Caspase8 | 绿色 | 490nm | 525nm |
Caspase9 | 蓝色 | 370nm | 450nm |
表1. Caspases 3/ 7、8和9的光谱波长
3.百萤 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性细胞凋亡复用检测试剂盒实验方案
简要概述
1. 用测试化合物准备细胞
2. 加入等量的半胱天冬酶工作溶液
3. 在室温下孵育30分钟至1小时
4. 检测荧光强度
溶液配制
工作溶液配制
1.单胱天蛋白酶活性工作液：将50 µL底物（组分A，B或C）加入10 mL分析缓冲液（组分D）中，制成caspase 3/7，caspase 8或caspase 9工作溶液，并充分混合。
2.双胱天蛋白酶或三胱天蛋白酶活性工作液：将每种半胱天冬酶底物50 µL加到10 mL的测定缓冲液（组分D）中，制成工作溶液。 注意：请按比例准备被测底物溶液和所需的体积。
实验步骤
1.通过向PBS或所需的缓冲液中加入10 µL /孔的10X测试化合物（96孔板）或5 µL /孔的5X测试化合物（384-板）来处理细胞。对于空白孔（不含细胞的培养基），添加相同量的化合物缓冲液。
2.将细胞板在37°C，5％CO2的培养箱中孵育（对于用星形孢菌素处理的Jurkat细胞需要3-5小时）以诱导凋亡。
3.加入100 µL /孔/ 96孔或25 µL /孔/ 384孔的所需caspase分析工作溶液。
4.在避光的条件下，在室温下孵育平板至少30至60分钟。注意：如果需要，可在室温下添加测定上样溶液10分钟之前，向选定的样品中添加1 µL 1 mM caspase抑制剂，以确认对caspase活性的抑制。
5.按照顶部或底部读取模式，检测荧光强度。注意：有时，底部读数可提供更好的信噪比，如果使用底部读数模式，则以800 rpm的速度离心细胞板（特别是非贴壁细胞）2分钟（制动）。
图示：
图1. Jurkat细胞中胱天蛋白酶活性的检测。 当天将Jurkat细胞以200,000个细胞/孔的方式接种在Costar黑色96孔板中。用星形孢菌素以1 mM的终浓度处理细胞4小时（红色条），而未处理的细胞用作对照（蓝色条）。 添加单胱天蛋白酶测定加载溶液（100 uL /孔）（对于caspase 3/7在＃1中，对于caspase 8而言在＃2中或对于caspase 9在＃3中）或三次胱天蛋白酶测定加载溶液（对于caspase 3在＃4中 一起添加/ 7、8和9），并在室温下孵育1小时。 使用FlexStation荧光酶标仪在波长下测量荧光强度。 胱天蛋白酶3 / 7、8和9的活性可以在一次测定中检测到，而不受其他胱天蛋白酶的干扰。
图2. cSBL通过caspase途径诱导H2452和MSTO细胞凋亡。 通过蛋白质印迹法（A，B）或荧光法（C，D）检测到Caspase-3，-8和-9的活化。 荧光测定法独立进行三次，数据表示为平均值±SD。 这些实验与对照相比的统计显著性显示如下：* P<0.05，** P <0.01，*** P <0.001。 来源：Tatsuta T等人，PLOS，2018年1月，来自牛蛙卵的唾液酸结合凝集素在体外和体内抑制人恶性间皮瘤细胞生长。
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