注：PE和APC的完整操作步骤及标记方案在最后两页，如果不需要看介绍，可直接跳过
藻红蛋白(R-PE及B-PE)
特点：
1.从红藻中纯化
2.具有高的发射量子产率
3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭
4.高水溶性
R-PE与B-PE的区别：
Wavelength(nm)
Wavelerngn(mm)
R-PE与B-PE的对比：
| R-PE | B-PE |
分子量 | 240,000 | 240,000 |
最大吸收 | 565 nm | 545 nm |
额外的吸收峰 | 498 nm | 564nm |
最大发射 | 573 nm | 573 nm |
消光系数(ε) | 1.96x106 M-1cm-1 | 2.41x106 M-1cm-1 |
荧光量子产率(QY) | 0.84 | 0.98 |
吸收比 | A566/A280≥5.0 A566/A498<1.5 A620/A566<0.01 | A545/A280≥5.5 A565/A496<2.7 A620/A545<0.01 |
特点：
1.从蓝藻中纯化
2.具有高的发射量子产率
3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭
4.高水溶性
APC和C-PC的区别：
APC和C-PC的对比：
| APC | C-PC |
分子量 | 104,000 | 264,000 |
最大吸收 | 651nm | 651nm |
最大发射 | 662nm | 647 nm |
消光系数(ɛ) | 7.3x105 M-1cm-1 | 1.53x106cm-1M-1 |
荧光量子产率(QY) | 0.68 | 0.81 |
吸收比 | A650/A620≥1.25 A650/A280≥4.5 | A652/A620<0.3 A620/A280>4 |
交联APC和APC的对比：
1.APC结构：它具有α和β亚基，具有明显的(αβ)3四级结构。
2.为什么要将APC进行交联？答：交联是为了防止APC在稀释或暴露于变性盐(如尿素或盐酸胍)时发生可逆解离，从而保持其结构和功能稳定。
3.如何进行APC交联？答：通过α和β亚基间的特异性交联可以阻止APC的分解。
交联比：>1.0
| NaClO4 | A650:A620 |
CL-APC | | 1.465849387 |
CL-APC+NaClO4 | + | 1.386850153/ |
| NaClO4 | A650:A620 |
APC | | 1.587272727 |
APC+NaClO4 | + | 0.317901235 |
注：图中的红色线条为没有添加NaClO4，蓝色线条为添加了NaClO4。
如图及表中信息所示，CL-APC图中添加NaClO4及没添加NaClO4，吸收比没有明显变化。而在未交联的APC中，添加NaClO4，得到的吸收比有非常大的变化，因为APC中加入了NaClO4导致了它出现了解离。
特点：
1.存在于大多数光合作用的甲藻中
2.高水溶性
3.大斯托克斯位移
光谱特性：
| PerCP |
分子量 | 35,000 |
最大吸收 | 483nm |
最大发射 | 676nm |
消光系数(ε) | 4.0x105 M-1cm-1 |
荧光量子产率(QY) | 1.0 |
亮度(exQY) | 4.9x105M-1cm-1 |
吸收比 | A482/A280>4.0 |
一、PE的制备
1.将PE纯化。缀合前的浓度通常为5-10mg/ml。注意：PE在缀合前作为SAS(硫酸铵钠)沉淀物稳定。如果将PE以SAS沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。
2.使用3.5毫克R-PE修饰每毫克lgG，包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。
3.检查PE的纯度和浓度，请测量280、565和620nm处的吸光度。(1mg/ml的PE在565nm处的OD为8.2)。565/620比率>50表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280比率> 5表示已充分去除所有其他蛋白质。
二、PE的活化
1.使用前在无水DMSO中制备10mg/ml的SMCC储备溶液。
2.每毫克PE加入11μlSMCC，并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60分钟。
3.将纯化的PE过凝胶过滤柱来交换缓冲液。
注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC相对于PE的量，可能会有所好转。
三、1gG还原
1.在蒸馏水中制备1MDTT(15.4mg/100μl)的新鲜溶液。
2.1gG溶液浓度应为4mg/ml或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES、磷酸盐和TRIS缓冲液(pH范围为6至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于2mg/ml，则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。
3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升IgG溶液加入20μlDTT原液并搅拌。室温下静置30分钟无需额外搅拌(以尽量减少半胱an酸再氧化为胱an酸)。
4.将还原的lgG通过预平衡的“交换缓冲液"过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。
5.此步骤后尽快进行缀合。
注意：对于结合较差或失败的情况，降低DTT浓度可能会有所帮助。
四、进行缀合
1.每毫克IgG添加3.2毫克SMCC-PE。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60分钟。注意：这些摩尔比(每IgG约2个PE)效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。
2.60分钟后，必须去掉lgG上未反应的游离巯基。
3.在1.0ml干DMSO中制备10mgNEM的新鲜溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室温下包裹并旋转20分钟。
2.60分钟后，必须去掉lgG上未反应的游离巯基。
3.在1.0ml干DMSO中制备10mgNEM的新鲜溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室温下包裹并旋转20分钟。
注1：整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对APC的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为2mg/ml的抗体溶液。请您在进行APC抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。
注2：SMCC-APC缀合物非常稳定(在“交换缓冲液"中，在4C下至少可以稳定几个月)。因此，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10毫克或更多的APC，并将其用于几次抗体实验(在几周内)。SMCC-APC的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。
一、APC的制备
1.将APC纯化。缀合前的浓度通常为5-10mg/ml。注意：APC在缀合前作为SAS(硫酸铵钠)沉淀物稳定。如果将APC以SAS沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫升1升的“透析缓冲液"透析之前，用每毫升1升APC的PBS进行透析2次。
2.使用1.7毫克APC修饰每毫克lgG，包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。
3.检查APC的纯度和浓度，请测量280、620和655nm处的吸光度。(1mg/ml的APC在655nm处的OD为5.9)。655/620比率>1.4表明杂质被充分去除；655/280比率>4表明所有其他蛋白质均已充分去除
二、APC的活化
1.使用前在无水DMSO中制备10mg/ml的SMCC储备溶液。
2.每毫克APC加6μlSMCC，并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60分钟。
3.将纯化的APC过凝胶过滤柱来交换缓冲液。
注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC相对于APC的量，可能会有所好转。
三、1gG还原
1.在蒸馏水中制备1MDTT(15.4mg/100μl)的新鲜溶液。
2.1gG溶液浓度应为4mg/ml或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES、磷酸盐和TRIS缓冲液(pH范围为6至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于2mg/ml，则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。
3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升IgG溶液加入20μlDTT原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌(以尽量减少半胱an酸再氧化为胱an酸)。
4.将还原的lgG通过预平衡的“交换缓冲液"过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。
5.此步骤后尽快进行缀合。
注意：对于结合较差或失败的情况，降低DTT浓度可能会有所帮助。
四、进行缀合
1.每毫克IgG添加1.5毫克SMCC-APC。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60分钟。注意：这些摩尔比(每1gG约2个APC)效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。
2.60分钟后，必须去掉lgG上未反应的游离巯基。
3.在1.0ml干DMSO中制备10mgNEM的新鲜溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室温下包裹并旋转20分钟。
2.60分钟后，必须去掉lgG上未反应的游离巯基。
3.在1.0ml干DMSO中制备10mgNEM的新鲜溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室温下包裹并旋转20分钟。
