01「百萤v-iFluor 700标记简介」
膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白家族。它们富含真核生物，属于参与信号转导的普遍存在的细胞质蛋白家族。 膜联蛋白V的优先结合配偶体是磷脂酰丝an酸(PS)，其通常保持在细胞膜的内叶(细胞质侧)。在细胞凋亡中，PS被转移到质膜的外部小叶。磷脂酰丝an酸在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的通用指示，并且可以在观察到形态变化之前检测到。我们的膜联蛋白V结合物是一组监测细胞功能的工具，旨在通过测量磷脂酰丝an酸的易位来监测细胞凋亡。
膜联蛋白V结合物在Ca2+存在下与凋亡细胞表面上的PS结合，它也可以通过坏死细胞膜或死细胞并与细胞内部的PS结合。因此，我们建议将细胞不可渗透的核染色与膜联蛋白V结合物结合使用，以区分死细胞和凋亡细胞。
02「百萤Annexin V-iFluor 700标记适用仪器」
流式细胞仪、荧光显微镜
03「百萤Annexin V-iFluor 700标记实验方案」
概述
用测试化合物(200μL/样品)制备细胞
添加Annexin V结合物测定溶液
室温孵育30-60分钟
用流式细胞仪或荧光显微镜分析
1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：
1.1制备膜联蛋白V结合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。
1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间(用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时)以诱导细胞凋亡。
1.3离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。
1.4将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中(来自步骤1.1)。
1.5在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。
可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。
1.6在室温下孵育30至60分钟，避光。
1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)以增加体积(参见下面的步骤1.8)。
1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度(参见下面的步骤2或3)。
2.使用流式细胞仪分析：
通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。
注意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。
3.使用荧光显微镜分析：
3.1移取步骤1.6的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)冲洗1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)重悬细胞。将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。
注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白V缀合物孵育(步骤1.6)后，用膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)冲洗1-2次，并将膜联蛋白V结合测定缓冲液(来自步骤1.1)加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。在与膜联蛋白V缀合物孵育后，细胞也可以在2%甲醛中固定，并在显微镜下观察。
3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞
04「百萤Annexin V-iFluor 700标记数据分析」
下图是使用流式细胞仪检测膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝an酸在Jurkat细胞凋亡中的结合活性的实例。在活的非凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6%。在凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝an酸结合，磷脂酰丝an酸位于细胞膜的外部小叶上，导致染色强度增加。
图1.在Jurkat细胞中检测膜联蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰丝an酸的结合活性。将Jurkat细胞在37℃，5%CO2培养箱中不用(蓝色)或用1μM星形孢菌素(红色)处理5小时，然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分钟。使用FACSCalibur(Becton Dickinson，San Jose，CA)流式细胞仪，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下测量膜联蛋白V-mFluor Violet 450的荧光强度。
