C。Immunoblotting

用Blotto（BlottoA或B；用抗牛第二抗体时建议使用BSA）封闭膜上的非特异位点，室温孵育30-60min。也可选择用不含Tween-20的Blotto，在封闭容器内4℃过夜孵育。

如果使用的是磷酸化特异抗体，建议向封闭液和抗体稀释液中加入50 mM NaF（NaF：sc-24988）抑制磷酸化酶。

封闭好的膜与*抗体（Blotto稀释）稀释液室温孵育1小时。（如果是磷酸化特异抗体，要用加了50 mM NaF的Blotto稀释液。）抗体*浓度根据滴度决定。建议起始稀释度为0.5-2.0μg/ml。用TBST洗膜3次，5min/次。

将膜与HRP或AP标记的第二抗体稀释液（Blotto稀释）室温孵育45min，稀释度1:500-1:2000。如果背景过高，第二抗体需进一步稀释（可达1:20000）。作ECL时，如果使用Cruz Marker^TM分子量标准（sc-2035），必须使用Cruz Marker^TM compatible secondary antibody作为可视化标准。

TBST洗膜3次，5min/次，然后TBS洗膜一次，5min。

将膜与化学发光试剂（sc-2408）孵育。如果发光化合物用于可见光检测，必须用HRP标记的第二抗体。

2．IP甲酸基肽受体1抗体说明书，Anti-FPR1价格

注意：本操作步骤可用于放射性或正磷酸盐标记的细胞。（放射性物质的使用及处理应遵循适当的条例如OSHA和NRC指导手册。）细胞标记必须在无待标记氨基酸残基或无磷酸盐的培养基中进行。建议标记前使细胞处于适当的饥饿状态。孵育培养细胞（100mm细胞培养皿上约80-90%

单层细胞汇合或培养瓶内含约2-5×10⁷个悬浮细胞）。通常，用传代贴壁细胞或2-5×10⁷个悬浮细胞可得到*标记。

用21号注射器针头或超声波反复裂解细胞。转移裂解物至微量离心管中。

可选择：用1.0ml冰预冷的RIPA冲洗细胞培养皿，与之前的合并处理。

4℃，10000×g离心10min。冰上转移上清（细胞溶解液）至新的微量离心管。

预处理细胞溶解液，加入1.0μg的control IgG（与*抗体的种属来源一致）和20μl悬浮的（25%v/v）琼脂糖偶联物（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。4℃孵育30min。

2500rpm（约1000×g），4℃离心30s。

转移上清或约100-1000μg总细胞蛋白至微量离心管中。加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗体（抗体浓度应滴定测定），4℃孵育1-2hrs。或者，可加入20μl*抗体琼脂糖偶联物，混匀，4℃孵育1hr-过夜；跳过下一步骤。

加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好管子，4℃振摇孵育1hr-过夜。

2500rpm（约1000×g），4℃离心30s，收集免疫沉淀物，小心吸弃上清。

用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次，每次重复以上离心步骤。

zui后一次洗涤后，小心吸弃上清，用40μl 2×电泳上样缓冲液（sc-24945）重悬沉淀。

样品煮沸2-3min，上样电泳分离免疫复合物，通过放射自显影观察结果。未用完的样品可保存在-20℃。

可选择：煮沸后，样品可经离心沉淀琼脂糖颗粒，然后SDS-PAGE分析上清。