2500rpm（约1000×g），4℃离心30s。转移上清（细胞溶解物）至干净的微量离心管。

1ml细胞溶解物或约100-1000μg总细胞蛋白，加入10μl*抗体琼脂糖偶联物，混匀，4℃孵育1hr-过夜。

可选择：如无*抗体琼脂糖偶联物，1ml细胞溶解物加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗体（抗体浓度应滴定测定），4℃孵育1-2hrs。加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好管子，4℃振摇孵育1hr-过夜。

2500rpm（约1000×g），4℃离心30s，收集免疫沉淀物，小心吸弃上清。

用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次，每次重复以上离心步骤。

zui后一次洗涤后，小心吸弃上清，用40μl 2×电泳上样缓冲液（sc-24945）重悬沉淀。

样品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上样孔上样5-10μl。

电泳并按WB程序作免疫杂交。

从100mm细胞培养皿（单层细胞80-90%汇合）移除培养基，PBS洗一次。

加入1-3ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液（sc-24948），4℃孵育10min。（注意：RIPA裂解缓冲液对某些激酶效果不好。需要优化裂解液成分来保持激酶活性。）

用21号注射器针头反复抽吸使细胞破碎充分，转移至15ml离心管中。

用1ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液，0.5%Triton X-100（sc-29112）冲洗培养皿，与原裂解液合并。

10000×g，4℃离心10min。4℃转移上清至新的离心管内。

转移1.0ml细胞提取物（上清）至1.5ml离心管中。加入1-10μl（0.2-2μg）*抗体（抗体*浓度经滴定测定），4℃孵育1hr。

加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好盖子，4℃振摇孵育1hr-过夜。

2500rpm（约1000×g），4℃离心5min，收集免疫沉淀复合物。小心吸弃上清。

1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次，每次重复上述离心步骤。

20μl适当的蛋白激酶缓冲液重悬沉淀（如50mM HEPES（sc-29097），0.1mM EDTA（sc-29092），0.01%BRIJ 35（sc-29087）），0.1mg/ml BSA，0.1% β-巯基乙醇（sc-29086），0.15M NaCl（sc-29108）。缓冲液成分根据所研究的激酶调整。

加入10-1000ng多肽底物。该底物/酶/细胞系的多肽底物浓度应根据经验决定。

准备1ml ATP混合物：930μl适当的蛋白激酶缓冲液，6μl 50mM ATP，pH7.0，20μl 2.0 M MgCl₂和44μl [γ³²P]-ATP[10mCi/ml]。每个样品加入10μl ATP混合物，30℃孵育30min。冰上放置。

加入等体积2×电泳上样缓冲液（sc-24945）终止反应，样品煮沸2-3min。样品可离心沉淀琼脂糖微珠（可选择）；分析上清。跑SDS-PAGE，通过放射自显影观察结果。未用完的样品保存在-20℃。检测中如用小肽底物，样品必须通过闪烁计数或其他标准方法而不是SDS-PAGE来分析。