1）-10℃甲醇溶液5min，自然干燥（推荐方法）；或

2）冰丙酮2min，自然干燥；或

3）1%甲醛-PBS 10min（保持湿润）。

PBS洗三次。

可选择：含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min，淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

95%乙醇清洁玻片，涂一薄层黏附剂，自然晾干。或使用预处理的玻片。

切片厚度4-10μm。室温贴片。切片保存在-70℃。固定染色前室温解冻切片。

可选择：含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min，淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

注意：组织内有丰富的*（引起高背景染色），建议甲醛固定，遵循石蜡包埋组织切片protocol，因为石蜡包埋组织中内源性*被破坏。

95%乙醇清洁玻片，涂一薄层黏附剂，自然晾干。或使用预处理的玻片。

切片厚度4-6μm。二甲苯脱蜡，3次，5min/次。依次过梯度酒精水化：100%乙醇，2次，10min/次，95%乙醇，2次，10min/次。去离子水浸洗1min。甩去切片上多余的液体。

*：切片用含0.1%*的0.01N HCl室温孵育10-20min。去离子水冲洗几次，甩去多余液体。

皂角苷：切片用含0.05%皂角苷的去离子水室温孵育30min。PBS至少洗3次，甩去多余液体。

所有反应步骤均于室温下湿盒内完成。使用前试剂盒试剂要先恢复至室温。操作中切片不能过干。每步操作完用吸引管吸除试剂，避免切片过干。要用足够的反应液覆盖标本（通常100μl/张切片就足够了）。

滴加*抗体室温孵育30min或4℃过夜孵育。抗体*反应浓度需经滴定确定；建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次，5min/次。

滴加预稀释的*化第二抗体或用含1.5%封闭血清的PBS稀释至1μg/ml的*化第二抗体，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。

滴加亲和素*酶反应物，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。

用提供的过氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出现理想染色止。注意监控单张切片的恰当显色时间。去离子水洗5min。可用苏木素（sc-24973）复染5-10s。迅速用去离子水洗几次。

 梯度酒精，二甲苯依次脱水：浸没入95%乙醇2次，10s/次，然后100%乙醇2次，10s/次，zui后二甲苯3次，10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加1-2滴封片固定剂（如Clarion，sc-24942），盖上盖玻片（sc-24975），光学显微镜下观察。

迅速加入1-3滴预稀释的*抗体。如果所用染色系统不含预稀释的抗体，就把*抗体用血清封闭液稀释至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS冲洗，然后切片浸没入PBS内洗2次，2min/次。甩去多余的液体。

滴加1-3滴*化第二抗体，孵育30min。清洗同上步。

滴加1-3滴HRP-链亲和素复合物，孵育30min。清洗同上步。

滴加1-3滴HRP底物混合物。显色30s-10min，或直至出现理想染色止。去离子水冲洗，然后切片浸没入去离子水内洗2次，2min/次。

复染，脱水，封片。（同ABC染色试剂盒）

每步操作完吸除反应液，但要避免样品过干。用足够的反应液覆盖样品（100-500μl/张切片）。

滴加含10%封闭血清-PBS，孵育20min，减少和IgG结合的非特异位点。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。

滴加*抗体，孵育60min。抗体*反应浓度应滴定决定；建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml，PBS洗3次，5min/次。

滴加*标记或荧光染料标记的第二抗体（用含1.5%-3%封闭血清的PBS稀释至1-5μg/ml），孵育45min。PBS洗3次。如果使用荧光染料标记的第二抗体，须暗室孵育，并省略下步。

滴加链亲和素-荧光素，暗室孵育15min。链亲和素标记物浓度需经滴定决定；建议PBS稀释至10-20μg/ml。PBS充分洗净。

用水相固定剂或90%甘油PBS溶液封片。

选择适当的滤镜在荧光显微镜下观察。室温避光保存切片（UltraCruz^TM固片剂：sc-24941）或保存在4℃（甘油/PBS固片剂）。

细胞表面染色

1）   溶解血红细胞。（注意：准备足够的细胞用于10份样品100μl/份检测）。

1ml全血加入14ml恢复至室温的1×FCM溶解液（sc-3621）中。

轻轻混匀，室温孵育3-5min。不要超过5min。

离心5min，弃上清，预冷的5ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。

离心5min，弃上清，预冷的1ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。

2）准备培养细胞。（注意：本protocol通常处理50ml培养细胞。单层细胞，切勿*消化！用0.2%EDTA/PBS溶液代替。1×PBS洗细胞1次。）

*计数细胞。

1000rpm离心5min，弃上清，用足够的1×PBS轻轻重悬沉淀至终浓度为1×10⁷细胞/ml。

每管加入100μl RBC溶解的全血或单细胞悬液。混匀，放在有盖的冰盒内孵育15-30min。

每管加入1.5ml FCM冲洗缓冲液（sc-3624），颠倒混匀。1000rpm离心5min，弃上清，500μl 1%多聚甲醛重悬沉淀。

测读分析数据。