磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶1抗体

1．        WB对照系统
阳性对照：有标准品，或阳性血清、阳性上清。
阴性对照：测血时用相应小鼠未免疫血清，测培养上清，用无克隆培养上清。
空白对照：不加一抗，用1%BSA代替。
无关对照（替代对照）：用无关项目一抗，或无关项目的抗体。
2.切割膜时，大小一般为3-5mm,一抗的体积为每条膜保证1ml。
3.KSHV、MCMV、HCMV项目测血时，血清稀释度为1:500-1:1000。
4. KSHV、MCMV、HCMV项目WB鉴定时，一抗如为IgG型,二抗采用AP-Anti mouse IgG（Whole molecule）,SIGMA,CAT#A-3562; 一抗如为IgM型，二抗采用AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422。
5.多肽项目WB鉴定，二抗全部采用AP-Anti mouse IgG（Whole molecule）,SIGMA,CAT#A-3562。

Preparation of cell lysates 

Collect cells （confluent T-25） by trypsinization and spin. 
Lyse the pellet with 100 µl lysis buffer on ice for 10 min. 
For 500,000 cells, lyse with 20 µl. 
Spin at 14,000 rpm （16,000 g） in an Eppendorf microfuge for 10 min at 4°C. 
Transfer the supernatant to a new tube and discard the pellet. 
Determine the protein concentration （Bradford assay, A280, or BCA） 
（We use the Bradford assay from Bio-Rad.） 
Take x µl （= y µg protein） and mix with x µl of 2x sample buffer. 
Boil for 5 min. 
Cool at RT for 5 min. 
Flash spin to bring down condensation prior to loading gel. 

B. Polyacrylamide gel （14.5 cm x 16.5 cm） 

Agarose plug:  磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶1抗体Anti-phospho-MEK1/MAPKK1（pSer298）
1% agarose dissolved in 1x Resolving gel buffer. 
（I make 50 ml, keep melting it as I need it, and re-adding water to maintain agarose conc.） 
Resolving gel: 24 ml of a 9% gel 
5.4 ml 40% acrylamide/bisacrylamide （29:1 mix） 
3 ml 8x Resolving gel buffer 
15.6 ml water 
12 µl TEMED 
60 µl 20% ammonium persulfate 
Stacking gel: 8 ml 
1 ml 40% acrylamide/bisacrylamide （29:1 mix） 
2 ml 4x Stacking gel buffer 
5 ml water 
8 µl TEMED 
21.6 µl 20% ammonium persulfate 

C. Preparation of gel 

Assemble the glass plates and spacers （1.5 mm thick）.