丝裂原活化蛋白激酶1抗体

SDS-PAGE电泳
① 将抗原（细胞裂解液、重组蛋白）样品置于凝胶加样缓冲液中，在100℃加热三分钟以使蛋白质变性。
② 设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般每个电泳道加样zui大体积为25µl,每个电泳道上样的zui低蛋白质量（每一条蛋白质条带）：0.1µg（考马斯亮蓝染色）-2ng（银染色）,zui高蛋白质量（蛋白质混合物）：20-40µg。
③ 把电泳装置与电源连接好，将电压调至200V，电流应流向阳极，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。
④ 从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。

免疫印迹操作-转膜
① 将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15-20min.
② 带上手套，裁剪好滤纸（Whatman,3MM CHR）和NC膜，滤纸和膜大小为83mm×75mm，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。
③ 打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫*浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。
④ 小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡（用转移缓冲液润湿并戴手套以转移缓冲液润湿胶面，小心将NC膜放在胶面上，从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气泡，注意一定要戴手套或镊子接触膜）。
⑤用去离子水清洗缓冲液槽，在缓冲液槽中放入搅拌子，将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽。
⑥将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。
⑦将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌，连接好转移电极恒压100V转移90min，若转移过夜则恒压30V。
⑧电转完毕后，将NC膜置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37℃2小时或4℃过夜。

免疫检测  丝裂原活化蛋白激酶1抗体 
一抗与靶蛋白的结合
① 封闭的膜用PBST漂洗2-3次。
② 将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条（一般为3 mm宽左右）按顺序置于加样槽中，作好实验记录，加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
③ 室温下于摇床孵育2h或4℃过夜。
④ 弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。
  酶标记二抗与一抗的结合
① 根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（用含0.5%脱脂奶粉的PBS稀释），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h或4℃过夜，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
②弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。

显色反应（注：二抗一般有两种常用标记酶，HRP和AP，其相对应的显色底物试剂盒为DAB和BCIP/NBT）
① HRP标记二抗显色
   用DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）显色，按顺序依次加Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸馏水中，避光，混匀，将膜加入显色液中避光显色15 min左右终止反应，记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存
②        AKP标记二抗显色
   用AKP缓冲液洗膜5min，弃去AP缓冲液，加入显色液（66µlNBT溶液同10mlAKP缓冲液充分混合均匀后加入33µl BCIP溶液1h内使用），室温下显色（37℃可加速反应），显色反应通常在30min内可完成。用20mM EDTA/TBS洗膜终止反应,记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。反应溶液可预先配置，可在4℃储存一年以上。