Ets转录因子家族ets1抗体

Western bloting的操作（间接法）
1、        蛋白质样品（抗原）的制备：
①  细胞的处理方法：向收集到的细胞中加入RIPA裂解缓冲液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，终浓度为2ug/ml）在冰上裂解30—60min，然后再插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次，再离心12000rpm3-5min，吸取上清备用。（超声强度不能过大，防止蛋白碳化）
组织的处理方法：按实验要求将组织从动物体内取出（样品不宜反复冻融），取少量（1-2g左右）放入玻璃匀桨器中研磨成匀浆，然后转入EP管中进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次5-7秒，重复5-6次，再离心12000rpm3-5min，吸取上清备用。
②上述两种方法得来的样品处理液还要加入1/4体积左右的上样Buffer，然后放在沸水浴中加热3-4min使蛋白变性，方可作为样品点样。（注意：在加热组织裂解液时，肝脏和肾脏组织要特别注意其本身浓度，是在制作裂解液时就适当稀释，否则加热后会凝结成固态。还有些组织处理后很粘稠，有带丝状物，这是未裂解的核酸，可以适当离心后再用。）
2、        SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
①根据要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝胶（一般釆用10%的SDS－PAGE）
②将已配制好的凝胶装入电泳仪中（注意不要漏液）。
③设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般裂解液我们按10-20ul/道点样，重组蛋白按1-2ug/道点样。
④把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V电泳10-20min，待溴酚蓝迁移出积层胶位置再换用200V，30-40min后关闭电源。
⑤从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用水冲洗干净，准备转膜。
4．转膜（湿转）
① 将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡几分钟。
② 带上手套，准备好滤纸和NC膜（83mm×75mm），尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。
③ 打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫*浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的滤纸。
④ 按“海绵—滤纸—凝胶—NC膜—滤纸—海绵”的顺序装置好（注意不能有气泡且装置电极槽不能放反） Ets转录因子家族ets1抗体 
⑤将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。
⑥将整个装置放在冰浴中用磁力搅拌器搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移90min。电转完毕后，将NC膜作好记号置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37℃2小时或4℃过夜。
5．加一抗与抗原结合
①将加样槽洗涤干净，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条并作好记号，按顺序置于加样槽中加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
②室温下于摇床孵育2h或4℃过夜。
③弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽中的膜用PBST在摇床洗涤洗涤5min左右 ，换液，反复4-5次。
6．加二抗与一抗的结合
① 根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（PBS稀释），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
②弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加PBST在摇床洗涤洗涤5min左右，换液反复4-5次。
7．显色反应（重组蛋白一般用AP显色或是DAB显色，裂解液一般用发光法）
① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存
②        AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66µlNBT溶液和33µl BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37℃可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。
③底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱要控制好时间）