埃兹蛋白抗体相关信息

Western bloting要注意的一些问题
1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）
2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择zui适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。
3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。
4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。
5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。
6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是*标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有*，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。
8、在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，以看得清楚目的条带为标准。
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四、Western bloting在抗体生产中的应用
     Western bloting是用来对蛋白质进行检测的一种常用方法，通过抗原抗体的免疫反应可以定量测出抗体的相对分子量，以及抗体的相对丰度或与已知抗原的关系等等。目前它应用在多个领域,在临床上检测传染病和自身免疫病、过敏症等，在抗体生产领域它与ELISA、ICC、IHC、IFA等免疫技术相接合已成为单克隆抗体生产的主要筛选手段。
     在单抗的筛选过程中通常釆用几中免疫技术并存的方式进行筛选，针对不同的抗体釆用不同的技术，有利于提搞抗体生产的筛选效率，下面就针对几种常用的方法与Western blot进行比较：
方法        ELISA        WB        IHC/ICC        免疫荧光（IFA）
操作        简单，周期短        复杂，周期长        较简单        较简单（要专门的荧光显微镜）
灵敏度        高，易产生假阳性        高，特异性高        较WB低        较ICC高
交叉        有.        有，易识别（根据抗原分子的大小）        有，难识别        有
准确度        定性        定性定分子量        定位        定位
载体        酶标板        凝胶、膜        玻片        玻片
结果        普通显色        化学化光/普通显色        普通显色        荧光
在抗体检测中Western bloting经常要注意到目标抗体与抗原（细胞/组织裂解液）的接合能力，特别是交叉现象，所以一定要设置好对照实验。同时还有测血、测母克隆亚克隆过程中一定要注意抗体的稀释倍数以及二抗的使用等等。
总而言之，做Wetern bloting实验熟练撑握原理和操作是前提，关键是统筹整个实验流程，合理安排，注意细节，这样才能保证实验的性和准确性。