（1）将抗原共价结合到固相支持物上zui简单的方法，是将抗原结合到活化的微球上。现有商家提供各种不同的支持物。这些活化的基质的应用将于第九章讨论。如果必须使用这些基质，首先推荐使用有弹性空间臂的基质。它能保证结合抗原的活性位点与微球自身之间合适的距离。
如果使用多肽抗原，应将抗原直接连接到活化微球上。
如果使用多肽抗原，将其直接连接到微球上，而不是将它先连接到一载体分子上。如果合成肽在其一端有自由氨基或羧基基团，通过此基团将肽直接连接到微球上。在个别情况下，合成肽不具有这些基团，这种肽应通过与制备抗原相同的方式将它们连接到载体分子上。这些载体分子必须不同于那些用于免疫的载体分子（例如可以用BSA—肽纯化针对KLH—肽产生的抗体）。否则，针对载体分子的抗体也将被纯化。尽管任何分子在理论上都能用作载体，但建议纯化抗体时的载体选用与制备抗体时使用的载体类似的大分子蛋白质。
抗体样本的缓冲液中不能有外源性的化合物，它们能与活化微球的反应基团结合。zui常见的结合过程是针对抗体上的氨基基团（或琉基，如果用氯化甲苯磺酰）。如果在抗体纯化时已用过这些化合物，抗体样本应用0．5mol／L磷酸钠结合缓冲液（pH7．5）充分透析。
（2）用0．5mol／L的磷酸钠溶液（pH7．5）制备抗原溶液。留小量样品以检测结合率（将在第5步中进行）。待结合的抗原量依不同的实验而异。在多数情况下，10mg的抗原加到lml的微球上将得到高容量柱。
同所有蛋白质溶液一样，应避免过度的机械作用或与空气接触以尽量避免蛋白变性。
（3）加入根据厂家推荐的方法准备好的活化微球。
（4）用摇床在室温下轻柔混匀2h或4℃过夜。
（5）用0．5mol／l磷酸钠溶液（pH7．5）洗涤微球2次，收集过夜结合的上清液。比较缓冲液中前后蛋白的含量。如果抗原有*、*或苯*残基，可比较其280nm处的吸光度值。也可用考马斯亮蓝染SDS-PAGE后的条带。
（6）用lmol／L氯化钠溶液和0．05mol／L磷酸钠溶液（pH7．5）洗涤微球一次。
（7）加入10倍体积的100mol／L乙醇胺（pH7．5），室温下孵育4h或4℃过夜，轻轻摇匀。
（8）PBS洗2次。
（9）将结合有抗原的微球装柱。有些结合的抗原可能在洗脱抗体时亦被洗脱，预洗涤时，去除这些抗原非常重要。在本例中，抗体即能在低pH值，又能在高pH值时释放出来，所以要用这些缓冲液对抗原柱进行预洗涤。
先用10倍微球体积的10mmol儿Tris（pH7．5）溶液洗柱，再用10倍微球体积的100mmol／L*（pH2．5）洗涤，然后用10倍体积的10mmol／L Tris（pH8．8）洗脱。检测zui后出柱的Tris洗液的pH值。如果不是8．8，继续洗涤。接着加入10倍体积100mm01／L三乙胺（pHil．5，新鲜配制）。用10mmol／LTris洗涤直至洗液的pH值达到7．5为止。
（10）将多克隆血清过柱，使抗体与柱上的抗原结合。血清上柱前应无任何沉淀，如果有，应通过离心或用蛋白A或蛋白G色谱柱（见前）纯化抗体，以便除去沉淀。如果样品是血清，上柱前用10mmol／LTris（pH7．5）将血清以1：10稀释。抗体溶液过柱时应用蠕动泵使其以低流速过柱。
使用高pH和低pH溶液洗脱，只能洗脱出一部分结合到柱上的抗体。一些高亲合力抗体在这些条件下仍不能被洗脱，因此zui终将导致抗体结合容量降低。如果遇到这种情况，又不能得到新层析柱，可以用更苛刻的试剂洗脱，如1．5mol／L硫氰酸钾、4mol／L尿素或3．5mol几氯化镁，它们可能使层析柱再生，用来制备有用的抗体，但取决于抗体的性质。
（11）用20倍微球体积的10mmol／LTris（pH7．5）洗涤柱，然后用20倍体积的500mmol／L氯化钠，10mmol／LTris（pH7．5）依次洗脱。
（12）通过用10倍体积100 mmol／L*溶液（pH2．5）过柱，可以洗脱对酸敏感的抗体。将洗脱液收集在盛有1倍微球体积的1mol／LTris溶液（pH8．0）中。
（13）用10mmol／LTris（pH8．0）洗涤柱，直至pH值升至8．8。
（14）通过用10倍体积100mmol／L三乙胺溶液（pHll．5，新鲜配制）过柱，可以洗脱对碱敏感的抗体。将洗脱液收集在盛有1倍微球体积的lmol／LTris溶液（pH8．0）中。
（15）用10mmol／LTris（pH7．5）洗涤柱，直至其pH为7．5。将柱子存放于含0．01％柳硫汞的缓冲液中，以便以后重新使用。
（16）将各抗体溶液混合，并用含0．02％氯化钠的PBS溶液透析。如果有必要，通过蛋白A或蛋白G柱浓缩抗体。