上海金穗生物科技有限公司

在固相抗原上选择噬菌体抗体

时间:2012-12-24阅读:355
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1.用溶于PBS的2m1抗原(10—1000ug/m1) 包被免疫管,室温过夜。碳酸盐缓冲液也可使用。
2.用PBS洗涤试管3次,并用2%MPBS封闭非特异性结合位点,放在旋转的转台上,37℃l小时。
3.用PBS洗涤试管3次;加入lml滴度为10lz~1013的噬菌体抗体(稀释于lml 4%MPBS中),在旋转的转台上孵育30分钟,再静止1.5小时。
4.用PBS/PBS/Tween洗涤试管1次,并用PBS洗涤2次。每次洗涤是将缓冲液倒入和倒出试管。
5.加入1.Oml 100mmol/L三乙基胺,给试管加盖,然后再转台上转动8分钟。
6.将洗脱液转移至1个新试管中,并立即加入0.5mllmol/LTris—HCl(pH 7.4) 中和并混匀。
7.将一半体积的洗脱液(0.75m1)加入到10m1对数生长的大肠杆菌TGl或DH5αF,(A600值为0.5)中;37℃孵育培养液30分钟,不用振荡。
8.取1P1培养液在100mmTYE/amp/glu平板上铺板以滴定洗脱的噬菌体。
9.以4000r/minl5分钟离心剩余的培养液。重悬于0.5ml 2XTY培养基中,并在两块150mmTYE/amp/glu平板上铺板。
10.准备下一轮选择所需的噬菌粒颗粒:感染辅助噬菌体,但要将起始培养体积降至10m1(步骤1),并扩充培养体积至50ml。由于体积变小,可用台式离心机操作。将噬茵体重悬于终体积为1.Oml的PBS中,并用大肠杆菌TGl测定噬菌体滴度。
11.从步骤1开始,重复进行选择,共2~4轮。*轮过后,要增加洗涤的严谨性:洗脱前,用PBS/Tween洗涤20次并用PBS洗涤20;hQ。用PBS和PBS/Tween进行一次或两次时间为30分钟的洗涤步骤,也能提高严谨性。

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