我们开始先用VLCDR3随机化，是因为它一般比VHCDR3短，更重要的原因是可以在同源结构上建模。VLCDR3随机化技术也较VHCDR3简单一些，这是因为它位于scFv基因的3，端。因此，随机化过程只需两步PCR即可完成。在*步PCR中，随机化引物（VLFOR）和引物LMB3可以扩增大部分scFv基因，并将突变导人CDR3。第二步PCR扩增scFv的其余部分，并添加1个用于片段克隆的限制性位点。

多样化VL CDR3构建scFv基因文库的策略。
随机化VLCDR3分两步PCR进行。在*步PCR中，随机化引物（VLFOR）和引物LMB3可以扩增大部分scFv基因，并将突变导人CDR3。第二步PCR扩增scFv的其余部分，并添加1个用于片段克隆的限制性位点NotI

现在可以用添加了NotI限制性位点的引物再扩增scFvVI-基因文库。用NcoI和NotI消化再扩增的产物，克隆到噬菌体展示载体pHENl中，并将产物电转化人大肠杆菌。

建文库后，可选择和筛选的更高亲和力抗体。我们通常采用来自VLCDR3突变中亲和力zui高的突变体，作为VHCDR3突变的起始抗体。

用于VLCDR3多样化的引物定位和设计。
用于CDR3随机化的引物是以进行亲和力成熟的抗体V基因序列为基础的。VL CDR3（下划线区域）中7个氨基酸被随机化。框架3（FR3）末端和框架4（FR4）起始端用实线标出